Horváth László (szerk.): Halbiológia és haltenyésztés (Mezőgazda Kiadó, Budapest, 2000)
1. Biológiai alapismeretek - 1.4 Orbán László: Molekuláris eljárások alkalmazása a haltenyésztésben
1.4.2.3. Gélelektroforézis A biomolekulák elektromos térben felületi össztöltésüknek megfelelően vándorolnak. Amennyiben a vándorlás térhálós szerkezetű polimer mátrixokban (gélek) zajlik, úgy az elválasztásban szerepet játszik a méret, sőt az alak is. Ez utóbbi folyamatot nevezzük gélelektroforézisnek. A DNS molekulák töltése és alakja az esetek többségében hasonló, így elválasztásuk a fragmenthossz, azaz a méret alapján történik (26A. ábra). Gélként használható agaróz, keresztkötött, sőt lineáris poliakrilamid is. Speciális alkalmazás a kapillárisokban történő elválasztás, melyet fluoreszcensen jelölt DNS fragmentek elválasztására alkalmaznak (pl. bázissorrendek meghatározása). 1.4.2.4. Klónozás A klónozás a génsebészet alaptechnikája, mely során egy bizonyos DNS szakaszt restrikciós endonukleáz enzimekkel kivágunk a genomból, majd egy olyan vektor DNS-be építjük be, mely baktériumsejtekben gyorsan felszaporítható. Vektorként leggyakrabban rekombináns plazmidokat alkalmaznak, melyek egykor baktériumokból izolált, azok szaporodási ciklusától függetlenül sokszorozódni képes gyűrű alakú DNS molekulák specializált származékai. A rekombináns génkonstrukciót tartalmazó plazmidot erre a célra előkészített, fellazított sejtfalú baktériumokba juttatják (transzformálás), majd a transzformált sejteket a megfelelő antibiotikumot tartalmazó tápoldatban felnövesztik. Az antibiotikum jelenlétében csak azok a sejtek maradnak életben, amelyek tartalmazzák az antibiotikum elleni rezisztenciát kifejező plazmidot (szelekció). Egy éjszaka alatt a vektor mennyisége akár milliárdszorosára növelhető egy liternyi baktériumszuszpenzióban. Az így nyert plazmidok - a természetes mutáció okozta meglehetősen ritka változásoktól eltekintve - pontos másolatai, azaz kiónjai a kiindulási plazmidnak, mennyiségük pedig lehetővé teszi a beléjük épített DNS szakasz részletes analízisét. 1.4.2.5. Hibridizációs eljárások A DNS kettős spiráljának két szálát a rajtuk elhelyezkedő bázisok specifikus pároso- dása tartja össze. Ezen a bázispárok kapcsolata szigorúan meghatározott, így egy adott DNS fragment egymástól elválasztott (denaturált) szálai képesek egymást több millió lehetséges partner közül megtalálni és összepárosodni (hibridizáció), míg össze nem illő bázissorrendű szakaszok között megfelelő körülmények között nincs párosodás. Ha egy DNS fragmentet (próbát) megjelölünk, majd oldatban lévő vagy membránhoz rögzített denaturált DNS-sel inkubáljuk, akkor a próba hozzákötödik párjához, melynek jelenléte így a próbán levő jelölés segítségével kimutatható (26B. ábra). A próbát radioaktívan, immunológiai eljárással vagy floureszcensen jelölhetjük. A membránra cseppentett DNS-folton végzett hibridizációt dot blot-nak, míg az agaróz gélen végzett elektroforézissel méret szerint elválasztott DNS-fragmentek membránra „átnyomtatott” mintázatának hibridizációs analízisét Southern hibridizációnak (26B. ábra) nevezzük. 146
