Horváth László (szerk.): Halbiológia és haltenyésztés (Mezőgazda Kiadó, Budapest, 2000)
1. Biológiai alapismeretek - 1.4 Orbán László: Molekuláris eljárások alkalmazása a haltenyésztésben
sokszorozódik (replikálódik). A gerincesek mitokondriális genomjának mérete mindössze 16—17 ezer bázispár (16—17 kb) ez mindössze kb. 1%-a annak, amekkorára az ősi baktériumok teljes örökítőanyagát becsülik4. A mitokondriális DNS (mtDNS) számos olyan tulajdonsággal rendelkezik, melyek elősegítették vizsgálatát: 1) sejtenként általában többezer példányban fordul elő; 2) alakja (felcsavarodott kör5) és kis mérete miatt viszonylag könnyű elkülöníteni a sejtmagi genomtól; 3) szinte kizárólag anyai úton öröklődik; 4) a rendelkezésre álló adatok azt mutatják, hogy az egy sejtben jelenlevő eltérő szekvenciájú mitokondriális DNS-ek között nincs génkicserélődést eredményező kettős szálcsere (rekombináció). A nyolcvanas évek során számos állatfaj mtDNS-ének meghatározták a teljes szekvenciasorrendjét. Ezek összehasonlító vizsgálata azt mutatta, hogy szerkezeti elemeik a gerincesekben viszonylag jól konzerváltak, a 37 kódoló régió mellett mindössze egy (esetleg kettő) nemkódoló szakasz található. Ezen vizsgálatok során arra is fény derült, hogy a mtDNS szekvenciája jóval gyorsabban változik az evolúció során, mint a genomiális DNS-é. 1.4,2. A molekuláris biológia alapvető eljárásainak bemutatása 1.4.2.1. DNS izolálás A DNS izolálás egyik legrégebbi, ma is igen jól használható eljárása az ún. fenol-klo- roformos kezelés. Szövetekből végzett izolálás esetén a sejteket fel kell tárni és fehérjebontó enzimmel a fehérjéket fel kell darabolni. Ezt követően az oldatot fenollal keverjük el, mely a fehérjéket inaktiválja és eltávolítja a nukleinsavak mellől. Az oldatban maradt fenoltól kloroformos kezeléssel lehet megszabadulni. Az így kapott híg oldatból a nukleinsavakat sós-alkoholos oldatban történő kicsapással, a kapott csapadék mosásával, kiszárításával majd feloldásával lehet szelektíven kinyerni. 1.4.2.2. DNS hasítása restrikciós endonuklcáz enzimekkel A restrikciós endonukleáz enzimek a baktériumokat védik az idegen (elsősorban virális eredetű) DNS-ek káros hatása ellen. Hatásuk azon alapul, hogy az idegen eredetű DNS-t speciális (a két szálon ellenkező irányba olvasva ugyanazt a bázissorrendet mutató, pl. GAATTC) motívumokban, az ún. palindrom szekvenciákban eldarabolják. Az enzimek izolálása és jellemzése lehetővé tette alkalmazásukat kutatási célokra, így a génsebészet talán legfontosabb alapvető eszközeivé váltak. Amennyiben a hasítás eredményeképpen létrejövő DNS fragmentek végeinek formája és bázis- sorendje megegyezik, úgy akár különböző fajokból származó fragmentek is összeil- leszthetők. így állítják elő az ún. rekombináns génkonstrukciókat (mesterséges úton összerakott génkonstrukciók; lásd még 1.4.2.4.). 4 A maradék feltehetően olyan funkciót kódolt, amely a sejtmagi genomban már megvolt, ezáltal feleslegessé vált, és fokozatosan elveszett az evolúció során. 5 Angolul „supercoil”. 145
