Szemészet, 2013 (150. évfolyam, 1-4. szám)
2013-03-01 / 1. szám
Új kísérleti módszer a könnymirigy ductus epithelium vizsgálatára Louis USA). A pipettavég belső átmérője 50-150 /mi közötti volt. Intakt könnymirigy ductusok izolálása Az állatok humánus leölése után mindkét könnymirigy kimetszésre került. A szövetkárosodás minimalizálása érdekében azonnal +4 °C hőmérsékletű tároló oldatba helyeztük a mirigyeket, majd +4 °C hőmérsékletű steril üveglapra kerültek a további feldolgozás céljából. A kötőszövetes állománytól és a zsírszövettől történt megtisztítás után a mirigyszövetbe 1 ml izoláló oldatot mikroinjektáltunk steril rozsdamentes acéltűt (26 GxW', 0 0,45x12 mm) használva. A mikroinjektált mirigyszövetet steril pengével kis darabokra vágtuk és Pasteur-pipettával 2 ml izoláló oldatot tartalmazó steril üveglombikba helyeztük. Rövid oxigenizáció (100% 02) után 37 °C-os vízfürdőben 25 perces inkubáció következett, amelynek végén az izoláló oldatot eltávolítottuk és 5 ml +4 °C- os tároló oldatra cseréltük. Az enzimatikus emésztésen átesett szövetet a kollagenáz tartalom minimalizálása érdekében két alkalommal átmostuk a tároló folyadékkal, majd a mikrodisszekció kezdetéig +4 °C-on tároltuk. A könnymirigyszövet-darabkákat ezután Pasteur-pipettával steril üveg tárgylemezre helyeztük, hideg fényforrású Nikon sztereomikroszkópot (Jencons-PLS, Grinstead, UK) használtunk a további munkához. Az intra- és interlobuláris ductusokat mikrodisszekciós módszerrel, 26 G X Vi“ (0 0,45x12 mm) rozsdamentes acéltűvel izoláltuk. Az izolált ductusokat mikropipetta segítségével friss tároló oldatot tartalmazó petricsészébe helyeztük. 20-30 perces izolálás után a szövetdarabkát friss, +4 °C-os mintára cseréltük, így 4-5 izolálási periódus alatt kb. 15-20 ductust nyertünk. Szövettenyésztés Az intakt könnymirigy ductusok ezután polikarbonát-hidrofil membránra (10,0 fim pórusnagyság; Whatman International Ltd., Kent, UK) kerültek, amelyeket tenyésztő oldatot tartalmazó petricsészébe, a folyadékfelszínre helyeztünk. A ductusokat ezt követően egy éjszakán át 37 °C-os, 5% C02/95% 02 keverékkel áramoltatott termosztátban inkubáltuk. Elektronmikroszkópos vizsgálat A könnymirigy ductusok ultrastrukturális jellemzőinek meghatározásához elektronmikroszkópos vizsgálatokat végeztünk. A vizsgálatokhoz a ductusokat közvetlenül az izolációt követően 2,5%-os glutáraldehidben fixáltuk, majd 1%-os ozmium tetroxidos fixáció következett. Etanolos dehidrációt követően a mintákat epoxi gyantába ágyaztuk be. Az elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz az ultravékony metszeteket uranil-acetáttal és ólom-citráttal kontrasztoztuk. A vizsgálatokhoz transzmissziós elektronmikroszkópot (Philips CM10, Eindhoven, Hollandia) használtunk. Intracelluláris pH-mérés Az inkubációt követően a könnymirigy ductusokat adhezív anyag (Cell-Так, Becton Dickinson Labware) segítségével egy fedőlemezre (24 mm) fixáltuk, amely egy inverz sztereomikroszkóphoz (Olympus, Budapest) rögzített perfúziós kamra alapját képezte. A 37 °C-os standard HEPES-oldatban levő ductusokat pH-szenzitív fluoreszcens festékkel (BCECF-AM) telítettük: 2 fxmol/1 BCECF-AM, 25-30 perc expozíciós idő. A telítés után a ductusokat folyamatosan perfundáltuk (4-5 ml/min áramlási sebesség). Az intracelluláris pH méréséhez (pHi) CellR imaging rendszert (Olympus, Budapest, Magyarország) használtunk. A digitális adatgyűjtéshez használt területet manuálisan határoztuk meg (vizsgált terület=VT). Egy intakt ductus 4-5 kis területét, amelyek egyenként 5-10 sejtet foglaltak magukba, 490 nm-es és 440 nm-es fénnyel excitáltuk, és a 490/440-es fluoreszcencia emissziós arányt mértük 535 nm-en. Másodpercenként egy pHi mérést regisztráltunk. A fluoreszcens jel in situ kalibrációjához a magas K+-nigericin technikát alkalmaztuk (5, 17). A kalibráció során a ductusok magas K+-koncentrációjú, 10 fiM nigericint tartalmazó HEPES-oldatban voltak. Az extracelluláris pH 5,95 és 8,46 között változott. Statisztikai analízis Az adatok rendszerezésére, feldolgozására és statisztikai értékelésére Microsoft Excel programot (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) használtunk. Az eredmények statisztikai értékeléséhez két adatcsoport esetén Student-próbát, három vagy több adathalmaz összehasonlítása esetén ANOVA-programot használtunk. A p<0,05 értéket tekintettük szignifikáns eltérésnek. Az eredményeket átlag ±S.E.M (n = 3-5 ductus/10-22 VT) értékekkel fejeztük ki. Eredmények A könnymirigy ductusok morfológiai jellemzése Az ultrastrukturális vizsgálatok szerint a kis ductusok az apikális régióban számos mikrovillussal rendelkeznek, sok szekretoros granulumot, vesiculumokat, mitokondriumokat tartalmaznak (1. ábra A és В panel). Ezen sejtorganellumok nagy száma azt a feltételezést támasztja alá, hogy a ductalis epithelium aktív szekretoros tevékenységet végez. A basolateralis membrán az intersticiális tér felé határolja a ductusokat, a luminális (apikális) membrán a ductus belfelületét alkotja. A könnymirigy ductus epithelium pH szabályozása A kísérletek első sorozatában a könnymirigy ductus sejtek nyugalmi pH-jának meghatározása volt a cél. A ductusokat standard HEPES- oldatos (pH 7,4) expozíció után 8 percig magas K+-koncentrációjú HEPES (pH 7,28) oldatba, ezután 8 percig magas K+-koncentrációjú 41
