Szemészet, 2013 (150. évfolyam, 1-4. szám)
2013-03-01 / 1. szám
New experimental method to study lacrimal gland ductal epithelia Bevezetés A szem felszínét borító könnyfilmréteg kialakulásának egyik fontos tényezője a könnymirigy szekrétuma, amely vizet, mucint, ionokat és számos különböző proteint tartalmaz. A könny fiziológiás összetétele és megfelelő volumene elengedhetetlen a szemfelszín épségének fenntartásához (15, 16). A könnyfilm mennyiségi és minőségi változása szárazszem-szindróma kialakulásához vezethet, ami nem megfelelő gondozás mellett hosszú távon a szemfelszín irreverzibilis károsodását hozhatja létre (7, 12). A szervezet exokrin mirigyeihez (hasnyálmirigy nyálmirigy) hasonlóan a könnymirigyben három fő sejttípus: acinális, ductalis és myoepithelialis sejt található (13, 14). A könnyfilm volumenének legjelentősebb része az acinális és feltehetően a ductalis epithelsejtek produktuma. A könnymirigy fő kivezető járatának viszonylag könnyű kanülálhatósága lehetővé tette a szekrétum összetételének pontos meghatározását (9). A könnymirigy acinusok szekréciós működésének tanulmányozására ugyancsak rendelkezésre állnak metodikai eljárások, a könnymirigy-darabkák enzimatikus elóemésztése után acinus csoportok vagy szoliter acinusok izolálhatóak a további vizsgálatok céljára (20, 21). Az acinus sejtek működési mechanizmusairól a kutatások eredményeként egyre több adat áll rendelkezésre, a könnymirigy ductus epithelsejtek celluláris-molekuláris szintű működése és szabályozása azonban jórészt ismeretlen (4, 19). Nem állnak rendelkezésre a funkcionális vizsgálatokhoz szükséges metodikai eljárások sem, annak ellenére, hogy a ductalis epithelium jelentős fiziológiás szerepet játszhat a könnyfilm integritásának fenntartásában. A hasnyálmirigy esetében az izolált ductusokon végzett vizsgálatok eredményeként a sejtek működéséről (abszorpció, szekréció), szabályozásáról egyre több adat áll rendelkezésre, az acinális és ductalis sejtek szeparáltan vizsgálhatóak (1). Mindezek tükrében fontossággal bírhat olyan vizsgálati módszerek kidolgozása, amelyekkel mind fiziológiás, mind patológiás körülmények között lehetővé válhat a ductus sejtek működésének, regulációjának tanulmányozása. Jelen munka célja egy olyan vizsgálati módszer kidolgozása volt, amely a ductalis epithelsejtek funkciójának, regulációjának vizsgálati lehetőségét megteremtve új utat nyithat ezen struktúrák működésének pontosabb megismeréséhez. Anyagok és módszerek Kísérleti állatok A kísérletekhez 2-2,5 kg tömegű felnőtt Új Zéland nyulakat használtunk. A kísérletek a laboratóriumi állatok tartására és felhasználására vonatkozó irányelvek betartásával kerültek megtervezésre és kivitelezésre. A kísérleti protokollt a Szegedi Tudományegyetem Etikai Bizottsága előzetesen jóváhagyta. Az állatok leölése pentobarbitállal (50 mg/kg) történő szedáció után a nyaki gerinc diszlokációjával történt. Széles laterális canthotomia után a kötőhártya-áthajlást superotemporalisan megnyitottuk. A szemgolyó inferonasalis irányú diszlokációja mellett az orbita superotemporalis kötőszövetének részleges eltávolítása után a könnymirigyet óvatosan feltártuk és a lehető legkisebb roncsolással kimetszettük. A preparáció sztereomikroszkóp alatt történt. Oldatok és vegyszerek A standard HEPES-oldat összetétele (mmol/1): 130 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 D-glükóz, 10 Na-Hepes. A magas K+ koncentrációjú HEPES-oldat összetétele (mmol/1): 130 KC1, 5 NaCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 D-glükóz és 10 Na- HEPES. A Na+-mentes HEPES-oldat összetétele (mmol/1): 140 NMDGCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 D- glükóz, 10 HEPES-acid, 7,5-es pH-ra beállítva. A Ch-mentes HEPES- oldat összetétele (mmol/1): 140 Naglukonát, 2,5 K-szulfát, 6 Ca-glukonát, 1 Mg-glukonát, 10 D-glükóz és 10 Na-HEPES. A HEPES-pufferelt oldatok oxigenizálása 100% 02 átáramoltatásával történt, pH-jul< 7,4-re történő beállításához HCl-t vagy NaOH-t használtunk. A standard HCOy puffereit oldalt összetétele (mmol/1): 115 NaCl, 25 NaHC03, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2 és 10 D-glükóz. A Na+-mentes HCOy-pufferelt oldat összetétele (mmol/1): 115 NMDG-C1, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 D-glükóz, 25 cholin-HCOy, 8,0-as pH-га beállítva HCl-val. A Ch-mentes HC03 - oldat összetétele (mmol/1): 115 Naglukonát, 25 NaHC03, 2,5 K-szulfát, 6 Ca-glukonát, 1 Mg-glukonát, 10 D-glükóz. A HCC/r-pufferelt oldatok oxigenizálása 95% 02/5% C02 átáramoltatásával történt (pH 7,4, 37 °C). A szövetragasztó CellTak a Becton Dickinson Labware-tól (Bedford, MA, USA), a pH szenzitív fluoreszcein festék (2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-6- karboxifluorescein-acetoximetilészter: BCECF-AM) a Molecular Probes-tól (Eugene, OR, USA) került beszerzésre. Minden egyéb vegyszert a Sigmától (Budapest, Magyarország) vásároltunk. A kollagenáz beszerzése a Worthingtontól (Lakewood, NJ, USA) történt, a tenyésztő oldat alkotóelemeit (DMEM, McCoy oldat, fetális borjú szérum, glutamin és borjú szérum albumin) a Sigmától vásároltuk. Az izoláláshoz 100 U/ml kollagenázzal és 2 mg/ml borjú szérum albuminnal kiegészített DMEM-oldatot használtunk. A tároló oldat DMEM-et és 3% (w/v) borjú szérum albumint tartalmazott. A tenyésztő oldat összetétele: McCoy’s 5A szövettenyésztő médium, 10% (w/v) fetális borjú szérum, 2 mmol/1 glutamin. Az üvegpipetták beszerzése a Drummond Scientific Companytól történt (Broomall PA), formázásukhoz vertikális pipetta kihúzó eszközt használtunk (Technical Product International, INC, St. 40
