203984. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kutya coronavírus elleni vakcina előállítására
1 HU 203 984 B 2 3. táblázat MOI Peplomer fehérje Sejttel társult Vírussal társult 0,01 1221 0 0,04 2911 13 0,1 3805 93 0,4 7877 207 U 8927 646 A sejttel társult peplomer antigént másféle módszerekkel is előállíthatjuk. így pl. a peplomert lehet pl. immunaffinitás adszorpciós kromatográfiával tisztítani, szekvenciaelemzés után elő lehet állítani peptidszintézissel, vagy elő lehet állítani a peptid-szekvenciából származó DNS kódoló szekvencia kifejezésével valamely rekombináns gazda mikroorganizmusban vagy sejtben. Ezenkívül a peplomemek azokat a származékait, amelyek megőrzik a sejt-eredetű antigén immunprotektív tulajdonságait, elő lehet állítani standard rekombináns DNS technikával, fehérje-technikával vagy kémiai technikákkal. Bárhogyan is állítjuk elő, a vakcinát parenterálisan, pl. intramuszkulárísan vagy szubkután adjuk be a kutyáknak, előnyösen legalább 3 hónapos korukban. Előnyösen beadunk egy második dózist is 2-4 héttel az első beadás után. Az évenkénti újravakcinálás ajánlatos. Ha fiatalabb kutyákat vakcinálunk, ezeket előnyösen 3 hónapos korukban újra vakcináljuk. A vemhes nőstények vakcinálását valószínűleg legjobb elkerülni. Az egyes vakcinadózisok a sejttel társult peplomer hatásos mennyiségét tartalmazzák, azaz azt a mennyiséget, amely hatásos parenterális kétszeres vakcinálások után kutyák védelmében CCV fertőzés által okozott súlyos betegség-tünetek ellen, pl. gastroenteritis ellen. A fentebb leírt eljárást követően, amelyben az antigént sejttenyészet fertőzésével állítják elő, olyan folyadékot kapunk, amely tartalmazza ezt a hatásos mennyiséget Az ilyen folyadékot tipikusan hígítani lehet akár 1/10 arányban is, és ez még hatásos mennyiséget tartalmaz. Az egyes vakcinadózisok teljes térfogata tipikusan 0,5 és 2 ml, előnyösen 1-1,5 ml között van. A találmány szerinti vakcinát lehet kombinálni más vakcináié szerekkel polivalens vakcinákban, pl. más inaktivált (elpusztított) vagy legyengített kutyavímssal kombinálva. Az ilyen más vakcinakomponensek előnyösen valamely bélbetegséget okozó víms, pl. rotavirus vagy parvovirus, vagy ezekből számlázó más immunprotektív antigén. Több ilyen inaktivált és legyengített vírusvakcina és antigén ismeretes. Előnyös polivalens vakcina egy olyan bivalens vakcina, amely a jelen találmány szerinti vakcina és egy módosított élő vagy elölt parvovínis vakcina kombinációja. Az ilyen vakcina a jelen találmány szerinti sejttel társult peplomer és a módosított élő vagy elölt parvovínis vakcinához elegendő mennyiségét (pl. 6,3 log10TCID50 adagonként) tartalmazza. (TCID: szövettenyészet fertőző dózis. TCID50: az a vínismennyiség, amennyi a szövettenyészet sejtjei 50%-ának a fertőzéséhez szükséges.) A teljes dózistérfogat 0,5-2 ml, előnyösen 1-1,5 ml. Carmichael és munkatársai (4 303 645 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) ismertetnek egy módosított élő kutya parvovínis vakcinát, beleértve a vakcináié törzsek és hatásos dózisaik előállítását, amelyet lehet kombinálni a jelen találmány szerinti vakcinával, hogy találmány szerinti bivalens vakcinát készítsünk. Az ez után következő példák a találmány szerinti eljárás bemutatását szolgálják, és nem korlátozó jellegűek. 1. példa. Vakcina készítése Kutya coronavínis NL-18 törzset izolálunk olyan kutyák csoportjának székletmintájából, amelyek akut gastroenteritisben szenvednek. A kezdeti izolálás primer kutya-vesesejteken 50 pg dietil-amino-etil (DEAE) dextránt igényel a fenntartó tápközeg 1 ml-ére [alap tápközeg: Eagle (BME) Earle-sókkal (Grand Island Biological Co., Grand Island, New York)]. A további passzázsokhoz DEAE dextrán nem szükséges. A vírust 4 passzálással adaptáljuk a primer kutya-vesesejtben, és további 36 passzálással macska vesesejt-vonalban, amelyet a 73d-93d passzálási szintnél alkalmazunk. Gill [„Isolation and Characterisation of a Coronavirus”, doktori disszertáció (University of Nebraska, 1982. augusztus)] leírja a CCV NL-18 törzs izolálását;, ezt a törzset korábban CCV-18 törzsnek nevezték. -Gördülő palack tenyészetek vírussal való inokulálásához a macska vesesejtvonal tömör egy-rétegéről (monolayer) a tápközeget dekantáljuk. A tápközeget a fenntartó tápközeggel helyettesítjük, amely 4-8% Polybrene-vel (Sigma Chemical Co., SL Louis, Missouri) van kiegészítve; ez 2-10% vírust tartalmaz, amely viszont legalább 107,0 TCID50/ml hígítatlan vírus-titert (0,2-1,0 MOD tartalmaz. Az inokulált tenyészeteket 9-16 órán át inkubáljuk 35-37 °C hőmérsékleten. A fertőzés tipikus citopatikus hatással (CPE) érvényesül a sejt egy-rétegen, nevezetesen legömbölyített sejtek foltjaival. Az inkubálás után és mikroszkopikus vizsgálat után, hogy a CPE-t igazoljuk, a fenntartó tápközeget dekantáljuk és eldobjuk. 100 ml térfogatú Hals tápközeget adunk minden egyes 500 ml-es gördülő palackhoz. A Hals tápközeg Eagle alap-tápközeg (BME) Hank-féle sókkal (Grand Island Biological Co., Grand Island, New York), amely 0,5% laktalbumin hidrolizátummal (Humko Sheffield, Memphis, Tennessee) van kiegészítve. A tenyészeteket azután -50 °C hőmérsékleten fagyasztjuk 6 órán át. Felengedtetés után binér etilénimin (BEI) oldatot adunk hozzá 1% (térfogat/térfogat) végső koncentrációban, hogy ínaktiváljuk a megmaradó vírusrészecskéket. A BEI oldatot úgy készítjük el, hogy 2,05 g 2-bróm-etil-amint és 0,8 g nátrium-hidroxidot adunk 100 ml vízhez. Az inaktiválást 35-37 °C hőmérsékleten végezzük, 35°-37 °C hőmérsékletet tartva fenn állandó kevertetéssel 2 napos inkubálással. Az inaktiválást úgy fejezzük be, hogy hideg (4 °C) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
