203984. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kutya coronavírus elleni vakcina előállítására
1 HU 203 984 B 2 nátrium-tioszulfát oldatot adunk hozzá 0,25% (tömeg/térfogat) végső koncentrációig. Tartósítószerként mertiolátot adunk hozzá 1:10 000 végső koncentrációban. A végső vakcinát úgy állítjuk elő, hogy a sejttenyésztő folyadékot összekeverjük fenntartó tápközeggel, majd adjuvánsként etilén-malein-sav-anhidridet adunk hozzá 0,2% végső koncentrációban. A vakcina tipikusan 20% sejttenyésztő folyadékot, 60% fenntartó tápközeget és 20% adjuváns oldatot tartalmaz, térfogat szerint számolva. Az adjuváns oldatot úgy készítjük, hogy etilén-maleinsav anhidrid (EMA) 91, Monsanta, St. Louis, Missouri) törzsoldatát hidráljuk 10 n nátrium-hidroxid hozzáadásával. Az EMA törzsoldat az alábbiakat tartalmazza: Vegyes anyag gramm/liter NaCl 0,5 KH2P04 0,565 Na->HP04 0,135 EMA 91 10,0 fenol-vörös 0,135 2. példa A vakcina által biztosított védelem tanulmányozása Primer kutya vesesejtekben negyedik passzálási szintnél levő CCV-71-et átviszünk A-72 sejtvonalra (ATCC CRL 1542), megfelelő térfogatokra osztjuk, és -70 °C hőmérsékleten tároljuk. A vírust virulens fertőző vírusnak nevezzük, és úgy standardizáljuk, hogy 105,3 TCIDj0-et tartalmazzon milliliterenként (a CCV- 71 azonos az ATCC VR-809-cel). Az A-72 sejtvonalat az ATCC-től szerezzük be a 33. passzálási szintnél (ATCC CRL 1542). Ezen a passzálási szinten az A-72 sejtek nem érzékenyek a CCV fertőzésre. A sejtvonalat sorozatban szaporítjuk 100 egymást követő passzálással, és a 139-140. passzálási szintnél alkalmazzuk a CCV szaporításhoz és tisztításhoz. Ezen a passzálási szinten az A-72 sejtvonal nagyon fogékony a CCV rögzítésére és replikálására. Fiatal, egészséges kutyakölyköket (8-14 hetesek), amelyeknek nincs ELISA titere CCV-re, alkalmazunk a kísérletekben. Ezeket elkülönítő berendezésekben helyezzük el a kísérleti vizsgálatok időtartama alatt. Összesen 20 kutyakölyöknek adunk szubkután két 1 ml-es adag vakcinát amelyet lényegében úgy készítünk, ahogyan ezt az 1. példában leírtuk; a két adag közt 21 nap van. Öt kutyakölyköt nem vakcinálunk, ezek a fertőzési kontrollok. A 20 vakcináit állatból és az 5 kontroliból vért veszünk a vakcinálás időpontjában. Majd vért veszünk a vakcinálás utáni 21. napon (abban az időpontban, amikor a vakcináit állatokat újra vakcináljuk), a második vakcinálás utáni 14. napon (amikor a kutyakölyköket provokáljuk és a provokálás (fertőzés) utáni 14. napon. A vakcináit állatoknak és a kontrolioknak nem adunk enni a provokálás előtt 18-24 órával. A provokálást 5 ml virulens, fertőző vírus szájon át végzett inokulálásával (105-3 TCID50/ml) végezzük. 18-24 órával a provokálás után a fertőzött kutyakölyköket visszaállítjuk a normális étrendre. A provokálást követően a kutyakölyköket 14 napon át megfigyeljük a betegség vagy reakció jeleire. A megfigyelési időszak során a hőmérsékletet mérjük és vérmintákat gyűjtünk fehérvérsejt számláláshoz. Székletmintákat gyűjtünk naponta 21 napon át a CCV elleni bélsár-anütest (bél IgA antitest) meghatározásához. Az egyes vakcinálásokat követően az összes kutya jól van és normális marad. A 4. táblázat mutatja be a kulyakölykök víruscentralizációs (VN) antitest üteiét a vakcinálás előtt, második vakcinálás előtt és provokálás előtt. Az összes kulyakölyök VN szeronegatív az első vakcinálás idejében, és negatív marad, amikor a második adagot adagoljuk. A fertőzés időpontjában (két héttel a második vakcinálás után) a VN titer a 0-16 közti tartományban van, a titer mértani átlaga 5. Az 5. táblázat mutatja be a kutyák és a vérvételek adatait ugyanúgy, mint a 4. táblázatban, de ELISA-t alkalmazva az antitest-üterek meghatározásához. Akutyakölykök szeronegatívak az első vakcinálás időpontjában, és ezek közül csupán 7 mutat antitest-választ a második vakcinálás időpontjában. A provokálás időpontjában az összes kulyakölyök jó ELISA anütest ütert mutat. 14 nappal a provokálás után a provokált kontroll kutyakölykök ELISA antitest titerének mértani átlaga 3880, míg a vakcináit állatok ELISA antitest üterének mértani átlaga >19 106 (5. táblázat). A vakcináit állatok magas Immorális antitest ütere a vakcinálásnak és a provokálást követő jó másodlagos válasznak tulajdonítható, és ez a védelemre utal. A provokálást követően néhány vakcináit állat rövid vagy átmeneti tüneteket mutat az étvágytalanságtól a hányásig. A provokálási kontrollállatok az étvágytalanság jeleit csak a provokálás után mutatják. Ezek a tünetek általában a provokálás után 6-10. napon figyelhetők meg. A provokálási kontroll kutyakölykök több klinikai tünetet mutatnak, mint a vakcináit csoport. A fehérvérsejtszámot a provokálástól számítva naponta figyeljük a betegség értékeléséhez. Szignifikáns leukopéniát nem figyelünk meg sem a vakcináit, sem a provokálási kontroll kutyakölykökben. Enyhe leukocitózis figyelhető meg a provokálási kontroll kutyakölykökben a 9. naptól kezdődően, és ez folytatódik a 13. napig. 4 táblázat Mintaoltás immunogenecitási vizsgálat Vírussemlegesítő antitest üterek (VN titerek) Kutya száma Vírussemlegesítő antitest titerek Vakcináitok Vakcinálás előtt 2. vakcinálás előtt Provokálás előtt Provokálás után DE-88 01 0 4 256 DE-89 0 0 16 1024 DE-90 0 0 2 256 DE-91 0 0 8 512 DE-94 0 0 8 1024 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
