203984. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kutya coronavírus elleni vakcina előállítására
1 HU 203 984 B 2 nyésztjiik, előnyösen 9-16 órán át, legelőnyösebben 9-12 órán ál A növesztő tápközeget ezután eltávolítjuk és a peplomert a sejtekből kinyeijük. Ezt előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy a használt folyékony tápközeget friss folyékony tápközeggel helyettesítjük, majd a sejteket szétzúzzuk, hogy kibocsássák a sejttel társult peplomert, amely a friss folyékony tápközegben gyűlik össze. A sejttel társult peplomert egyesítjük valamely parenterálisan elfogadható hígítószerrel vagy hordozóval a vakcinakészítményhez. Ezeket a lépéseket kényelmesen kombinálhatjuk a szétzúzás előtt használt folyékony tápközeg helyettesítésével olyan tápközeggel, amely parenterálisan tolerálható. A szétzúzást végrehajthatjuk pl. mechanikus, ultrahangos vagy kémiai úton, vagy ezek kombinációjával. Ezt kényelmesen elvégezhetjük a sejtek lefagyasztásával mintegy -40 - -70 °C hőmérsékletre. Felengedtetés után a folyadékot, amely a sejttel társult peplomert tartalmazza, összegyűjtjük. Mivel a tápközeget, amelyben a fertőzött sejttenyészet növekszik, eldobjuk, a friss, folyékony közeg lényegében mentes az extracelluláris vírusoktól, amelyek a fertőzött sejttenyészet növekedése során kiválasztódtak. A folyadékot azonban kezelni kell, hogy inaktiváljuk a maradék extracelluláris és intracelluláris vírusokat és nukleokapszidokat, amely intracelluláris részecskék és nukleokapszidok a szétzúzásra bocsátódnak ki. Bármilyen standard vírus inaktiválási eljárást lehet alkalmazni, amennyiben a peplomer nem denaturálódik. Ilyen technika például a besugárzás és a kémiai inaktiválás, pl. binér etilén-imin, béta-propiolakton, formaldehid, fenol vagy acetil-etilén-imin hozzáadás. Stabilizálószereket, adjuvánsokat puffereket és/vagy konzerválószereket, amelyek parenterálisan tolerálhatók, szintén adagolhatunk a végső vakcinához. így pl. az előnyös vakcina tartalmaz mertiolátot, pl. 1:60 000 arányban, és etilén maleinsav anhidrid adjuvánst pl. 0,2% mennyiségben. A találmány szerinti vakcina sejttenyésztéssel történő előállításában fontos, a CCV vakcina készítményekről szóló korábbi beszámolókkal ellentétben, hogy eltávolítsuk a használt folyékony tápközeget a sejtekből az összezúzás előtt. Bár az ok nem világos, a fentebb leírt módon készített, de használt tápközeget alkalmazva friss tápközeg helyett, vakcinák kisebb vírussemlegesítő antitest titereket alakítanak ki, mint a friss tápközeget tartalmazó vakcinák. Az alábbi 1. táblázat mutatja be a használt tápközeget és sejteket alkalmazva készített vakcina vírussemlegesítő antitest literét kutyakölykökben („Folyékony vakcina”) összehasonlítva olyan vakcinával, amely lényegében azonos módon készült azzal a kivétellel, hogy a használt tápközeget dekantáltuk és a találmány szerinti módon új tápközegre cseréltük („Sejtvakcina"). A kutyakölyök vírussemlegesítő antitesttiterei azt mutatják, hogy a „Sejtvakcina” védő immunológiai választ stimulál (a titer mértani átlaga 32) a második vakcinálás idejére. A vakcinálás utáni mintavétel idejére a válasz 108. mértani átlag titerre emelkedik. Ezzel ellentétben a „Folyékonyvakciná”val vakcináit kutyakölykök negatívak maradnak végig a vizsgált időszakon át. Ez meglepő eredmény, mivel a használt tápközeg tartalmaz CCV vírust, amelytől elvárható lenne, hogy részt vesz az immunvédelemben. 1. táblázat A „Sejtvakcinák” és használt „Folyadékvakcinák” potenciálja kutyakölykökben Vírussemlegesítő antitest-titér Csoport Kutya száma A második A második vakcinálás vakcinálás előtt után DE-70 32 128 „Sejtvakcina” DE-74 DE-76 69 16 128 64 DE-86 32 128 Titer geometriai átlaga 32 108 DE-78 0 0 „Folyadék-DE-80 0 0 vakcina” DE-82 0 0 DE-84 0 0 Titer geometriai átlagaAzokban a kísérletekben, amelyeket annak bemutatására szántunk, hogy a fertőzés utáni eltelt idő milyen fontos a sejttel társult peplomer antigén termelése szempontjából, a fehérje mennyiségét, amely sejttel társult, és azt a mennyiséget, amely a sejttenyésztő közegben van, és ezért vírussal társult, óránként meghatároztuk enzimmel kapcsolt immun-vizsgálat (ELISA) segítségével. Az antigén relatív mennyiségeit a 2. táblázatban mutatjuk be. Bár nem szándékozunk kötődni egy adott mechanizmushoz vagy magyarázathoz, úgy tűnik, hogy az idő hossza, amelyen át a sejteket tenyésztjük, fontos a változások miatt, amelyek a peplomerrel történnek később, a fertőzési ciklusban. 2. táblázat Órák a fertőzés után Peplomer fehérje Sejttel társult Vírussal társult 11 4830 475 12 3895 556 13 5946 748 14 7282 1454 15 4423 2044 A sejttel társult peplomer antigénről úgy találtuk, hogy a MOI értéktől is függ. A 3. táblázat adatokat mutat be olyan kísérletsorozatból, amelyben a MOI értéke 0,01 és 1,1 közti tartományban van. Az összes tenyészeteket 12 órával a fertőzés után nyertük ki, és az antigén mennyiségét ELISA- val határoztuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
