203984. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kutya coronavírus elleni vakcina előállítására
1 HU 203 984 B 2 metszetek immunfluoreszcenciáját, mind lehet alkalmazni a megfeleld etiológiai diagnózishoz. A coronavírusok nagy (mintegy 100 nm átmérőjű), burokkal ellátott RNS vírusok, amelyek csigavonalú nukleokapsziddal bírnak, jellegzetesen nagy bunkó alakú kiugrásokkal vagy tüskékkel, amelyeket peplomereknek nevezünk. Az RNS egyedi, lineáris szálat tartalmaz pozitív polaritással, durván 5,5 x 106 dalton molekulatömeggel. Az ultravékony szöveti metszetekben elektronmikroszkóppal megfigyelhető, hogy a vírus a citoplazmában levő vakuolumokba becsírázva található. A vírus antigenicitás szempontjából a Swine Transmissible Gastroenteritis vírussal (átvihető sertésgastroenteritis vírus) rokon. Acree és munkatársai a 4 567 042 és 4 567 043 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírnak egy inaktivált, illetve egy legyengített coronavírus vakcinát; mindkettő tenyésztett tápközeget tartalmaz. A találmány tárgya tehát eljárás vakcina előállítására, amely kutyák kutya coronavírussal (CCV) történő fertőzés által okozott betegséggel szembeni védelmére szolgál, amely vakcina sejttel társult CCV peplomer fehérje hatásos mennyiségeiből áll. A találmány szerinti eljárás az alábbi lépésekből áll: a) a vírus replikálására alkalmas sejttenyészet fertőzése legalább 0,2 MOI értékű CCV-vel (MOI: Multiplicity of Infection, a fertőzés sokszorozása); b) a sejtek tenyésztése 6-18 órán át; c) az elhasznált tenyészfolyadék elöntése; d) a sejtek szétzúzása; e) a szétzúzott sejtekből a sejttel társult peplomer fehérje összegyűjtése; és f) a sejttel társult peplomer kombinálása parenterálisan elfogadható hordozóval. A találmány tárgya további eljárás olyan polivalens vakcina előállítására, amely a sejttel társult CCV peplomer hatékony mennyiségét és egy vagy több más patogén organizmus vagy vírus ellen védő hatású antigén komponens hatékony mennyiségét tartalmazza. A találmány szerinti eljárással előállított vakcinák kutyák CCV fertőzés által okozott betegség elleni védelmére alkalmazhatók oly módon, hogy parenterálisan az állatoknak adagoljuk a találmány szerinti vakcinát. A CCV intracellulárisan replikálódik a fertőzés után. A replikációs ciklus folyamán a CCV RNS lefordítódik, hogy különböző szerkezeti és nem szerkezeti fehérjéket alakítson ki, amelyek a vírus replikációban érdekeltek. A kapszid fehérjék, beleértve a peplomer vagy E2 fehérjét, úgy tűnik, a membránhoz kötött poliriboszómákon fordítódnak le a durva endoplazmás retikulumnál. A vírus érési folyamata során a citoplazmás nukleokapszidok belecsíráznak az endoplazmás retikulumba, felvéve a kapszid fehérjéket, hogy érett vírus részecskéket képezzenek, majd külsőleg megnyilvánulnak a Golgi-apparátuson keresztül. A peplomer fehérje hasításon vagy más, transzláció utáni módosításon mehet keresztül a részecske képzést követően. Egyidejűleg bizonyos peplomer fehérjék, úgy tűnik, a sejtmembrán kettős lipid rétegébe beágyazva maradnak a fertőzött sejtbe való kezdeti belépéskor. Felismertük, hogy a sejttel társult peplomer fehérje, azaz a peplomer fehérje, amely a fertőzött sejtben a részecske-képződés előtt létezik, a kutyákban parenterális beadáskor immunválaszt indukál, amely válasz védő hatású azok ellen a betegségi tünetek ellen, amelyek normálisan társulnak a virulens CCV- vel történő fertőzéshez. Ez a felismerés meglepő annak a ténynek a fényében, hogy a teljes vírus, akár legyengített, akár inaktivált, viszonylag gyengén immunprotektív. A sejttel társult peplomer fehérjét (mintegy 203 000 dalton molekulatömeg) fertőzött sejtek megfelelő tenyésztésével és kinyerésével, szintézissel vagy géntechnikai módszerekkel lehet előállítani. Abból a célból, hogy a peplomert sejttenyésztéssel állítsuk elő, megfelelő sejttenyészetet vírussal fertőzünk és tenyésztjük. Bármilyen primer vagy folyamatos sejttenyészet, amely képes a vírus replikációjának elősegítésére, vagy amelyben a vírus adaptálható a replikálódáshoz, alkalmazható. Ilyenek például a primer kutyasejtek, pl. a kutya vesesejt és kutya timuszsejt; a kutya sejtvonalak, mint pl. a Madin Darby Canine Kidney sejtvonal és az A-72 fíbroblaszt kutya sejtvonal (ATCC CRL 1542); primer macska sejtek, mint a primer macska vesesejtek; macska sejtvonalak;' mint pl. a Crandall Feline Kidney sejtvonal és a Wood’s Feline sejtvonal; és más primer vagy folytonos emlős sejtek, mint pl. a Verő Monkey Kidney sejtve* nal. * A vírust a klinikai fertőzésekből ismert technikákkal lehet izolálni. Ilyen technika például egy fertőzött állat székletanyagának a szuszpendálása pl. szövettenyésztő tápközegben valamely polikation jelenlétében, majd egy primer sejttenyészet inokulálását az ebből kapott felülúszóval [lásd pl. Binn és munkatársai: Proc. 78th Ann. Mtg. U. S. Anim. Health Assoc., Roanoke VA October 359-366 (1974); Keenan és munkatársai: Am. J. Vet. Res. 37,247-256 (1976); és Tingpalapong és munkatársai: Am. J. Vet. Res. 43, 1687-1690 (1982)]. Egy virulens izoiátum, az 1-71 törzs, amelyet Binn és munkatársai izoláltak 1971- ben, többek között egyike azoknak, amelyek a köz számára rendelkezésre állnak. Ez beszerezhető pl. az American Type Culture Collectiontól (ATCC, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) ATCC VR-809 számon. Egyéb izolátumokról, pl. a K-328- ról, S-378-ról, A76-5-ről és az ATCC VR-2068-ról számolnak be Acree és munkatársai a 4 567 042 és 4 567 043 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban. Abból a célból, hogy a sejttel társult peplomer antigént termeljük és kinyerjük, a sejttenyészetet 0,2-2,0 víms részecske/sejttel fertőzzük, vagyis a fertőzési sokszorozás (MOI) 0,2-2,0 közötti értékkel egyenlő, és a MOI érték előnyösen 0,4 és 1,5 között van. A fertőzött sejteket a fertőzéstől számított 6-18 órán át te-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
