203933. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyapot regenerálására sejttenyészetből
1 HU 203 933 B 2 (e) lépés. Csírázás Az érett embriókat olyan szilárd tápközegre helyezzük, amely képes a csírázás redukálására. A tápközeg szervetlen sókat, vitaminokat és valamely szénforrást tartalmaz. A tápközeg megfeleld szilárdító anyaggal van szilárdítva, pl. Gelrite-vel (Kelko, San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok), agarózzal vagy agarral. A szervetlen sók lehetnek azok, amelyeket az (a) lépésben leírtunk, úgy módosítva, hogy a nitrát nagy koncentrációban legyen jelen, míg az ammónium-ion vagy teljesen hiányozzék, vagy csak igen kis koncentrációban legyen jelen. A nitrát koncentrációja 20-60 mmól/liter, előnyösen 30-60 mmól/liter, előnyösebben 35-45 mmól/liter. Az ammónium-ion koncentrációja ne legyen nagyobb, mint 5 mmól/liter. Az előnyös szénforrás valamely cukor. Az előnyös cukor a szacharóz. A szénforrás koncentrációja függ az alkalmazott szénforrás mibenlététől. így pl. amikor a szénforrás szacharóz, a koncentráció 0,1-6 tömeg%, előnyösen 0,5-4 tömeg%, előnyösebben 1-3 tömeg% között van. Az (e) lépés tápközegében adott esetben valamely redukált nitrogén tartalmú szerves vegyület is jelen lehet Ez a szerves vegyület előnyösen valamely aminosav, vagy aminosavak keveréke, amelyek képesek elősegíteni a csírázást. Az előnyös aminosav vagy aminosav-keveiék a glutamin, illetve a kazein-hidrolizátum. A csökkentett nitrogén-tartalmú szerves fonás koncentrációja függ az alkalmazott vegyület mibenlététől, így pl. ha a vegyület glutamin, a koncentráció 2-50 mmól/liter, előnyösen 5-30 mmól/liter, előnyösebben 10-20 mmól/liter lehet. Amikor az anyag kazein-hidrolizátum vagy módosított kazein-hidrolizátum, a koncentráció 100-3000 mg/liter, előnyösen 1000- 2800 mg/liter, előnyösebben 1500-2500 mg/liter. A csírázás előnyösen olyan tápközegen megy végbe, amely szerves nitrogénfonást tartalmaz, egészen addig, amíg hajtások keletkeznek. Az embriókat azután olyan tápközegbe visszük át, amely nem tartalmaz szerves nitrogénfonást, hogy a gyökerek megnyúljanak. Az embriók sűrűsége a tápközegben korlátozott olyan sűrűségig, hogy kevesebb legyen, mint az a sűrűség, amely a fejlődés öngátlását idézi elő. A megfelelő sűrűségek 1-100 embrió között vannak egy 9 cm-es petricsészén, amely mintegy 10-75 ml, előnyösen 25- 50 ml, és legelőnyösebben 35 ml tápközeget tartalmaz. Az (e) lépés szerinti tápközeget 20-30 °C hőmérsékletek között tartjuk fenn. Az előnyös hőmérséklet mintegy 25 °C. Az (e) lépésben valamennyi fény szükséges. Az 5 és 150 p Em"2S_1 közti fényintenzitás (=■ 417,5-12525 lux), előnyösen a 10 és 75 p Enr2S_1 közti fényintenzitás (= 835-6262,5 lux) a megfelelő. Az embriókat az (e) lépés tápközegén vagy tápközegein addig tartjuk fenn, amíg az embriók kicsíráznak, tipikusan 1-20 napig, általában 2-4 napig. Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy az embriók mikor csíráznak ki. (f) lépés. Növények A csírázást követően a csíranövénykét földbe viszszük át, hogy növénnyé növekedjen. Az átvitt növényeket kezdetben üveggel fedjük, hogy megmaradjon a nagy nedvességtartalom Egy hét üveg alatt tartás után a csíranövényeknek vagy növényeknek nem szükséges speciális kezelés. Felhasználás - Szaporítás Az érett embriókat tömeges szaporításhoz és klónozáshoz alkalmazhatjuk. Ez együtt jár az embriók csírázásával és a csíranövénykék földbe átültetésével, más növekedési szubsztrátumokba átvitelével vagy más növényi növekedési körülmények közé vitelével. Az érett embriókat be lehet zárni egy mesterséges magburkolatba és „szomatikus mag”-ként elültetni. A tömeges szaporítás és klónozás akkor előnyös, ha a hibrid szülőket vagy egy hibridet magát kell tömegtermelésbe fogni. A sejteket, pro-embriókat, embriókat, csíranövényeket és növényeket bármikor lehet elemezni a fentebb leírt stádiumok során abból a célból, hogy meghatározzuk, vajon van-e jelen valamiféle új jellemvonás, amely genetikai változás eredménye. A jellemvonás lehet hasznos in vitro vagy in planta jellemvonás. A hasznos jellemvonások között találjuk a fitotoxintűnést, szárazságtűrést, hidegtűrést, betegségtűrést stb. Az (a), (b) és (c) lépések sejtjeit is alá lehet vetni szövettenyésztési eljárásoknak, amelyek képesek olyan sejteket vagy növényeket termelni, amelyek kívánatos tulajdonságokkal bírnak, pl. herbicid tűrőképességgel. Az ilyen módszerekre példák találhatók az alábbi irodalmi helyen: ChaleíF és Ray: Science, 223,1148-1151 (1984). Példák 1. Táblázat - Tápközegek Az összes tápközeg tartalmaz Murashige és Skoog szervetlen sókat és Gamborg-féle B-5 vitaminokat, pH 5,7-re vannak beállítva, és összetételük az alábbi (a számértékek mg/l-t jelentenek): Makro-tápanyagok MgS04x7H20 370 KHjP04 170 KNOj 1900 nh4no3 1650 440 Mikro-tápanyagok H3BO3 6,2 MnS04xH20 15,6 ZNS04x7H20 8,6 NaMo04x2H20 0,25 CuS04x5H20 0,025 CuC12x6H20 0,025 KI 0,83 FeS04x7H20 27,8 Na2EDTA 37,3 Vitaminok TiaminxHCl 10 PiridoxinxHCl 1 Nikotinsav 1 Mio-inozit 100 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
