203933. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyapot regenerálására sejttenyészetből
1 HU 203 933 B 2 A fentieken kívül a különböző tápközegek az alábbi komponenseket tartalmazzák: A tápkőzeg száma további komponensek 1 20 g/liter szacharóz, 0,6% agar (Noble 2 30 g/liter glükóz, 2 mg/1 a-naftil-ecetsav, 1 mg/liter kinetin, 0,8% agar (Noble) 3 30 g/liter szacharóz, 2 mg/1 a-naftil-ecetsav, 1 mg/liter kinetin, 0,8% agar (Noble) 4 20 g/liter szacharóz, 0,S% picloram 5 20 g/liter szacharóz, 5 mg/12,4-diklór-fenoxi-ecetsav 6 20 g/liter szacharóz, 15 mmól/1 glutamin A tápközegeket 25 °C, 28 °C és 31 °C hőmérsékleten alkalmazzuk, és 16 óra fény/8 őrá sötétség fotoperiódussal, 20 pEm-2S_1 fényintenzitással (-1670 lux). 1. példa. Magsterilezés és -ültetés Gyapotmagokat (Gossypium hirsutum var. Coker 310) héjtalanítunk, a magot 2 percre koncentrált H2S04-be helyezve. A magokat azután négyszer mossuk steril desztillált vízben, 96%-os etanolba bemártjuk, lángoljuk és az 1. tápközegbe ültetjük 31 °C hőmérsékleten. 2. példa. Kallusz indukció Az ültetéstől számított hetedik napon a csiranövény hipokotüjait kimetsszük, hosszanti irányban felvágjuk, 2 mm-es darabokra vágjuk és a 2. tápközegre helyezzük 31 °C hőmérsékleten. Hipokotildarabokat (2 mm) viszünk át hetenként friss 2. tápközegre és ezeket a tenyészeteket 31 °C hőmérsékleten tartjuk fenn. A 4. heti 2. tápközegre történő átvitelt követően a bipokotildarabokon burjánzó kallusz szövetet eltávolítjuk az eredeti explantátumről és 3. tápközegre helyezzük 31 °C hőmérsékleten. A kalluszt friss 3. tápközegre visszük át egy hónap múlva, és további 1-2 hónapon át tartjuk fenn. 3. példa. Szuszpenziós tenyészet beindítása A szuszpenziós tenyészet beindításához 100 g kallusz tenyészetet helyezünk 35 ml 4. tápközegre 125 ml DeLong lombikban. A szuszpenziókat 6 héten át rázatjuk 140 fordulat/perccel, 28 °C hőmérsékleten, ekkor ezek gyorsan burjánzani kezdenek. 4. példa. Embriókifejlődés és növényregenerálás Az embriók, amelyek a 4. tápközegen képződnek, még gyorsabban burjánzanak a 4. tápközegről 5. tápközegre helyezéssel. Ezt az embriogén szuszpenziót elosztjuk és altenyésztésnek (átoltásnak) vetjük alá minden 3-7. napon friss 5. tápközegbe. Az 5. tápközegben burjánzó embriók kifejlesztéséhez az embriókat mossuk 6. tápközeggel, majd 6. tápközegre helyezzük. 3-4 héttel a 6. tápközegre történt átvitel után az érett embriókat szilárd tápközegre helyezzük 25 °C hőmérsékleten. A szilárd tápközeg módosított MS tápközeget tartalmaz, amely olyan MS sókat tartalmaz, amelyben 40 mmól/1 KN03 van KN03 és NH4N03 helyett, valamint tartalmaz B-5 vitaminokat, 2% szacharózt, 15 mmól/liter glutamint, és 0,2% Gelrite-vel (pH 5,7) van megszilárdítva. Az embriókat petricsészére helyezzük 25 °C hőmérsékleten. A hajtások kifejlődése szórványos ezen a tápközegen, és a gyökér megnyúlást megnöveljük olyan módon, hogy az embriókat a fenti módosított MS tápközegre visszük át amely nem tartalmaz glutamint A csírázó embriókat azután cserépben levő Vermiculite talajba ültetjük és főzőpohárral befedjük (25 °C). Miután a csíranövények a Vermiculite talajban kialakultak, a főzőpoharat eltávolítjuk. Egy hét múlva, 28 °C fokon végzett növesztés után, a csíranövényeket üvegházba kiültetjük, hogy tovább fejlődjenek növényekké. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás pro-embrionális gyapot sejttömeg előállítására folyékony szuszpenzióban, melynek során gyapot kalluszt folyékony, pro-embrionális sejttömeg képződést indukáló, legalább egy auxint tartalmazó közegben szuszpendálunk, amíg pro-embrionális sejttömeg csomós aggregátumai képződnek és gyorsan burjánzani kezdenek; azzal jellemezve, hogy a pro-embrionális sejttömeg gyorsan burjánzó csomós aggregátumait átvisszük finomabb diszpergált pro-embrionális sejttömeg képzésére alkalmas, legalább egy auxint a szuszpenziós tenyészközegek által szokásosan tartalmazó mennyiségnél nagyobb mennyiségben tartalmazó, továbbá szervetlen sókat, vitaminokat, 0,1-100 g/1 koncentrációban szénforrást, szerves nitrogén-forrást, citokinineket, aminosavakat és egyéb adalékokat tartalmazó tápközegre. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy auxinként 0,5-100 mg/liter koncentrációban 2,4- diklór-fenoxi-ecetsavat alkalmazunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyapotként Gossypium hirsutumot alkalmazunk. 4. Eljárás érett gyapot embrió előállítására folyékony szuszpenzióban, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított pro-embrionális gyapot sejttömegből torpedó-alakú vagy sziklevél-embriókat fejlesztünk ki úgy, hogy a pro-embrionális gyapot sejttömeget torpedó-alakú, vagy sziklevél-embriók képződését indukáló, szervetlen sókat, vitaminokat, 1—10 g/1 szénforrást, csökkentett nitrogén-tartalmú szerves vegyületet és adott esetben 0,01-0,1 mg/1 auxint tartalmazó tápközegre helyezzük. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyapotként Gossypium hirsutumot alkalmazunk. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a csökkentett nitrogéntartalmú vegyületként glutamint alkalmazunk, 2-250 mmól/liter koncentrációban. 7. Eljárás gyapot csíranövények előállítására, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerint előállított érett embriókat 20 °C-30 °C hőmérsékleten 5 p Enr2S_1 és 150 p Enr2S_1 közötti fényintenzitással embrió csíráztató tápközegben, mely szerveüen sókat, vitaminokat, szénforrást, adott esetben csökkentett nitrogén-tartal5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
