203933. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyapot regenerálására sejttenyészetből
1 HU 203 933 B 2 Amikor a pro-embriogén sejttömegek csomós aggregátumai gyorsan burjánzani kezdenek, ezeket közvetlenül be lebet vezetni a (c) lépésben leírt tápközegbe, vagy altenyésztést (átoltást) lehet végezni abból a célból, hogy megakadályozzuk a bámulást Az altenyésztés 3-7 naponként, előnyösen 5-7 naponként célszerű. A sejttömeg altenyésztés nélkül mintegy 14 napon át képes túlélni. (c) lépés. Finoman diszpergált pro-embrionális sejttömeg A pro-embrionális sejttömeg (b) lépésben kapott csomós aggregátumait olyan folyékony tápközegbe visszük át, amely képes előidézni azt, hogy a pro-embrionális sejttömeg csomós aggregátumai finoman diszpergálttá váljanak. A tápközeg lehet hasonló ahhoz, amelyet a (b) lépésben leírtunk, azzal a kivétellel, hogy a (c) lépés tápközege viszonylag nagy koncentrációban tartalmaz valamely auxint Az auxin lehet bármely auxin, amelyet az (a) lépésben alkalmazunk. Az előnyős auxinok a 2,4,5-triklór-fenoxi-ecetsav és 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav. A legelőnyösebb auxin a 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav. Az auxin koncentrációja függ az adott auxin mibenlététől. Az auxin koncentrációja a (c) lépésben általában nagyobb, vagy legalábbis annak a tartománynak a felső határán van, mint amelyet a szuszpenziós tenyésztő tápközegekben általában alkalmazunk, és minden esetben jelentősen nagyobb annál, mint az a megfelelő auxin-koncentráció, amelyet a (b) lépésben alkalmazunk. így pl. amikor a (c) lépésben az auxin 2,4-diklórfenoxi-ecetsav, a koncentráció 0,5-100 mg/liter, előnyösen 1-10 mg/liter, legelőnyösebben 2,5-7,5 mg/liter lehet. Az auxin koncentrációja és esetleg mibenléte kivételével a tápközeg, a hőmérséklet és a fényellátottság mértéke ugyanaz lehet, mint amelyet a (b) lépésben leírtunk. A (c) lépés körülményeit addig tartjuk fenn, amíg a pro-embrionális sejttömeg csomós aggregátumai kisebb, finomabban diszpergált pro-embrionális sejttömeggé nem válnak. A kisebb, finomabban diszpergált pro-embrionális sejttömeg megjelenése nyilvánvaló azok számára, akik a szakterületen jártasak. Ezt a sejttömeget sárga szín, sima felszín, közepes sűrűség és kis méret jellemzi. A sejttömeg fényképét a 4. ábrában mutatjuk be. Az átváltozás kisebb, finomabban diszpergált sejttömeggé általában 6 héten belül, tipikusabban 2 héten belül megy végbe. A kisebb finoman diszpergált pro-embrionális sejttömeg tenyészetét határozatlan ideig fenntarthatjuk, ésaltenyésztéseknek (ámításoknak) is alávethetjük, hogy fenntartsuk az aktív növekedést. Célszerű altenyésztést végezni minden 3-28, előnyösen minden 5-10 napon. (d) lépés. Érett embriók A kisebb, finomabban diszpergált pro-embrionális sejttömeget hozzáadjuk ahhoz a tápközeghez, amely az érett embriók kifejlődését indukálja. A tápközeg előnyösen folyadék. Az embriók egy sor fejlődési stádiumon haladnak keresztül, mielőtt megérnek és képesek lesznek csírázni. Ezek a stádiumok magukban foglalják a globuláris, szív-alakú, torpedó-alakú és érett stádiumokat. A stádiumok nevei az embriók hozzávetőleges alakján alapulnak. A (d) lépésben használatos tápközeg bármely olyan tápközeg lehet, amely érett embriók kifejlődését indukálja. Egy használható tápközeg szervetlen sókat, vitaminokat, valamely szénforrást és valamely redukált nitrogént tartalmazó szerves vegyületet tartalmaz. A sók és vitaminok és koncentrációik ugyanazok lehetnek, mint amelyeket az (a) lépésben leírtunk. A szénforrás szintén egyike lehet azoknak a szénforrásoknak, amelyeket az (a) lépésben leírtunk. A szénforrás koncentrációja 1-10 g/liter, előnyösen 2-6 g/liter. Az előnyös szénforrás a szacharóz. A redukált nitrogént tartalmazó szerves vegyület lehet az olyan vegyületek bármelyike, amely, amikor a (d) lépés tápközegéhez adjuk, érett embriók kifejlődését indukálja. Az előnyös vegyületek az aminosavak. Előnyös aminosav a glutamin. A szabad nitrogén szerves forrásának koncentrációja függ az alkalmazott anyag mibenlététől. Amennyiben a redukált nitrogén szerves forrásaként glutamint alkalmazunk, a hatékony koncentráció 2-260 mmól/liter, előnyösen 5-100 mmól/liter, legelőnyösebben 10-50 mmól/liter között van. A (cl) lépés tápközege tartalmazhat valamely auxint is. Az auxinok az embriókifejlődés korai stádiumában kívánatosak, míg a későbbi stádiumok során nem. Ennek megfelelően, ha egyáltalán vannak jelen auxinok, ezek előnyösen csak addig vannak jelen, amíg a kifejlődés szív-alakú stádiumában van. Ezután az embriókat olyan tápközegbe visszük át, amely nem tartalmaz auxint. Ha van jelen auxin a tápközegben, ennek koncentrációja 0,01-0,1 mg/liter között lehet. Az auxin azoknak az auxinoknak egyike lehet, amelyeket az (a) lépésben használunk. Az előnyös auxinok a picloram és a 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav. Az embriókat a (d) lépésben tenyészthetjük a 20 °C- 35 °C közti hőmérsékleten, sötétben vagy világosban. A fényintenzitás lehet pl. 5-75 p Enr2S_1 között («* 6262,5 lux). Az embriókat a (d) lépés tápközegében addig tartjuk fenn, amíg az embriók torpedó-alakúvá vagy érett állapotúvá nem érnek. Azok, akik a növényi szövettenyésztés szakterületén jártasak, képesek felismerni a globuláris, szív-alakú, torpedó-alakú és érett embriókat, amint keletkeznek. Ezeknek az embrióknak a fényképeit az 5-8. ábrában mutatjuk be. Az embriók tipikusan 2-5 hét, általában 3-4 hét alatt érnek meg. Általában nem szükséges az embriókat altenyésztésnek alávetni, vagy az embriókat friss tápközegbe átvinni, kivétel az az eset, amely akkor szükséges, amikor a szív-alakú stádiumnál az auxint tartalmazó tápközeget olyan tápközegre kell átcserélni, amely nem tartalmaz auxint 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
