203905. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ketonvegyületek mikrobiológiai enantioszelektív redukálására
1 HU 203 905 B 2 záljuk, ill. feltárjuk, az ebből kinyert sejtmentes extraktumhoz, amely az oxigénátvivő- enzimet és a kofaktorokat vízoldható formában tartalmazza, megfelelő mennyiségű glükózt és ketosztatint adagolunk, és a redukciót 25 és 30 °C közötti hőmérsékleten, több órán át végezzük. A továbbiakban az előzőekben leírtakhoz hasonlóan járunk el. A (II) általános képletű szekunder alkoholoknak az (I) általános képletű ketonokból mikroorganizmusokkal, előnyösen élesztőkkel végzett redukciójának előnyei a következők: az alkoholkihozatal az adduktumra vonatkoztatva, a felhasznált mikroorganizmustól, a ketosztatintól és az alkalmazott kiviteli formától függően 50-98%. A legjobb kihozatalt olyan (I) általános képletű ketosztatin alkalmazásával érjük el, amelynek képletében R1 jelentése benzilcsoport, R2 jelentése metilcsoport és amelynek képletében R1 jelentése 4-metilciklohexil-metil-csoport és R2 jelentése metilcsoport. A nem védett vegyületek esetében is igen kiváló a kihozatali érték. A kapott alkohol mennyiségére vonatkoztatva a biológiailag aktív S forma mennyisége (az OH- csoportot hordozó szénatom abszolút konfigurációja S) 90-99%, előnyösen 95-98%, a fentmaradó rész az R- konfígurációjú vegyület. A Hansenula nemzetséghez tartozó élesztők, különösen a Hansenula ciferrii, Hansenula satumus és Hansenula anomala fajokhoz tartozó élesztők alkalmazásával kapjuk a legnagyobb kihozatalt és az enantiomerek arányát csak igen kis mértékben befolyásolja. A találmány szerinti eljárással nyert (II) általános képletű szekunder alkoholok igen fontos kiindulási anyagok a reningátló vegyületek szintézisénél, amely vegyületek a gyógyászatban mint igen hatásos vérnyomáscsökkentők kerülnek felhasználásra. Az eddig ismert reningátló vegyületek mindegyikében megtalálható az -NH-CH-CHOH-CHí-CO-csoport. 1. példa Egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 100 ml 20%os glükózoldatban 2 g Hansenula ciferrii (DSM 70 780) élesztősejtet szuszpendálunk, majd az erjedés után a reakciókeverékhez 200 mg 5-fenil-4-(S)-BOC- amino-3-oxo-valeriánsav-metil-észtert adagolunk 5 ml etanolban oldva és a keveréket 28 °C hőmérsékleten állandó keverés közben inkubáljuk. 48 óra elteltével újabb 10 g glükózt adagolunk hozzá és az inkubálást további 24 órán át folytatjuk. A reakciót ezután etilacetát adagolásával leállítjuk és a keveréket még egy további órán át keverjük, majd a fázisokat elválasztjuk, a szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk és betöményítjük. A visszamaradó anyagot ciklohexán/terc-butilmetil-éterben felvesszük és szilikagélen kromatografáljuk (ciklohexán/terc-butil-metil-éter 1:1). Az átalakulás vizsgálatához és az enantiomerarány megállapításához az adduktum és a termék kis mintáját HPLC-vel a következőképpen vizsgáljuk: oszlop: RP 8, futtatószer: CH3CN/0,1 mólos NaH2P04 (1:1), detektálás 220 nmnél. A fentiek szerint 5-fenil-4(S)-BOC-amino-3(S)hidroxi-valeriánsav-metil-észtert nyerünk, enantiomertisztaság: 97%. 2. példa 100 g tenyésztett élesztősejtet (Hansenula satumus, DSM 70 278) 10 liter 10%-os glükózoldatban szuszpendálunk és hozzáadunk 100 ml etanolban oldott 10 g 5-fenil-4(S)-BOC-amino-3-oxo-valeriánsav-metil-észtert és a kapott keveréket enyhe levegőztetés mellett állandó keverés közben 28 “C hőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálást 72 óra elteltével összesen 5 liter etil-acetát hozzáadásával megállítjuk, a szerves fázist szilikagélen elválasztjuk, nátrium-szulfáton szárítjuk és átkristályosítjuk. Ily módon 5-fenil-4(S)-BOC-amino-3(S)-hidroxi-valeriánsav-metil-észtert nyerünk, enantiomertisztaság: 95%. 3. példa 150 mg 5-(4-metil-cikohexil)-4(S)-BOC-amino-3- oxo-valeriánsav-metil-észtert feloldunk 5 ml etanolban, hozzáadunk 100 ml 15%-os glükózoldatot, amely 1,5 g Hansenula ciferrii élesztősejtet tartalmaz és a továbbiakban az 1. példában leírtak alapján járunk el. Ily módon 5-(4-metil-ciklohexil)-4(S)-BOC-amino- 3(S)-hidroxi-valeriánsav-metil-észtert nyerünk, enantiomertisztaság: 80%. 4. példa Az 1. példában leírtakhoz hasonlóan eljárva, 200 mg 5-(4-terc-butil-ciklohexil)-4(S)-BOC-amino-3-oxo-valeriánsavból és 2 g kereskedelmi sütőélesztőből (Saccharomyces cerevisiae) kiindulva 5-(4-terc-butil-ciklohexil)-4(S)-BOC-amino-3(S)-hidroxi-valeriánsavat nyerünk, enantiomertisztaság: 64%. 5. példa 10 g tenyésztett élesztősejtet (Hansenula satumus) 1 liter 15%-os glükózoldatban szuszpendálunk, hozzáadunk 1 g 5-fenil-4(S)-amino-3-oxo-valeriánsav-metil-észtert 20 ml etanolban oldva és a továbbiakban az 1. példa szerint járunk el. Az inkubálás befejezése után az élesztősejteket centrifugálással elválasztjuk és vízzel átmossuk. A vizes felülúszókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Ily módon 5-fenil-4(S)-amino-3(S)-hidroxi-valeriánsav-metil-észtert nyerünk, enantiomertisztaság: 90%. 6. példa 1 g Hansenula ciferrii sejtet 1 ml 0,9%-os nátrium-klorid-oldatban szuszpendálunk, a szuszpenziót 4 'C hőmérsékletre lehűtjük és 2,4 ml vízben oldott 750 mg akrilamiddal és 40 mg N,N’-metilén-bisz(akrilamiddal) elkeverjük. A polimerizációt 0,1 ml 25%-os ß-dimetil-aminopropionitril és 0,5 ml 1%-os kálium-peroxi-diszulfát-oldat adagolásával elősegítjük. A polimerizáció után a gélt aprítjuk és a „szabad” élesztősejtek helyett alkalmazzuk az 1. példában leírtak szerint. 100 mg 5-fenil-4(S)-BOC- amino-3-oxo-valeriánsav-metil-észter redukálására, amikor is 5-fenil-4(S)-BOC-amino-3(S)-hidroxi-valeriánsav-metil-észtert nyerünk, enantiomertisztaság: 97%. 7. példa 2 g kereskedelmi sütőélesztőt 2 ml 0,1 n trisz-HCl-pufferral pH-75-nél 4 g üveggyöngy (0,45-0,50 mm) alkalmazásával sejthomogenizátorban kb. 4000 ford/perc 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
