203894. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszforsavtartalmú szkvalén szintetáz inhibitorok és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 203 894 B 2 Az elegyet nitrogéngáz alatt 4 'C-on, 5-15 percig állni hagyjuk, majd 30 ‘C-ra melegítjük és 0,2 ml, 21,9 pmól famezil-difoszfátot tartalmazó vizes oldat hozzáadásával megindítjuk az enzimreakciót A csövet ismét nitrogéngázzal töltjük fel, és az elegyet 30 ‘C-on 60 percig inkubáljuk. A reakciót 1,0 ml 40%-os vizes kálium-hidroxid-oldat és 1,0 ml 95%-os, spektroszkópos tisztaságú etanol hozzáadásával állítjuk be. Ezután belső standardként hexános oldatban 5 nmól dokozánt adunk az elegyhez és 30 percen át 65 'C-on hidrolizáljuk, majd szobahőmérsékletre hűljük, és kétszer 10 ml spektroszkópos tisztaságú hexánnal extraháljuk. A felső fázisként elváló, szerves oldószeres extraktumokat egyesítve 20 ml-es szcintillációs küvettába töltjük, és nitrogéngáz-áramban hozzávetőlegesen 1,0 ml-re bepároljuk. A mintát ezután áttöltjük egy kisavazott, 1,0 ml-es, kónikus fenekű üvegampullába, és nitrogéngáz alatt szárazra pároljuk. A maradékot újból felszuszpendáljuk 50 pl spektroszkópos tisztaságú hexánban, és 10 percig, szobahőmérsékleten, percenként 1000 fordulatszámmal centrifugáljuk. A centrifugálást követően a mintegy 40 pl-nyi felülúszót áttöltjük egy kisavazott, 100 pl-es peremes gumihártyával lezárható mikroampullába, amely a Hewlett-Packard gázkromatográf automata befecskendezőjéhez csatlakoztatható. Gázkromatográfia A kolonna egy DB-17 jelű, 15 m»0,525 mm-es, úgynevezett „megabore” zsugorított kvarc kapillárcső (J et W Scientific). A vizsgálandó mintából 2 pl-t fecskendezünk be a készülékbe, leosztás nélküli (splittless) üzemmódban. A gázsebességek az alábbiak: segédgáz (hélium) 20 ml/perc levegő 400 ml/perc hidrogén 30 ml/perc vivőgáz (hélium) 15 ml/perc öblítőgáz 5 ml/perc (az öblítés 0,00 percnél kikapcsol, 0,5 percnél bekapcsol) Az elpárologtató hőmérséklete 200 °C, a lángionizációs detektor hőmérsékletét 270 'C-ra állítjuk. A kemence hőmérséklete két egymást követő felfűtési szakaszra van programozva az alábbiak szerint: Induló hőmérséklet: 180 'C, idő: 10 perc Felfűtés sebessége: 20 'C/perc Második lépcső hőmérséklete: 250 ‘C, idő: 10 perc Felfűtés sebessége: 20 'C/perc Harmadik lépcső hőmérséklete: 260 'C, idő: 10 perc. (Az egyensúly beállásának ideje 1,0 perc). A fenti gázkromatográfiás rendszerben a belső standardként alkamazott dokozán retenciős ideje 3,6-3,7 perc, a szkvalén retenciős ideje 14,7-14,9 perc. Az egyes mérésekből származó reakcióelegyek szkvaléntartalmát a csúcs alatti területekből határozzuk meg. A teljes reakcióelegyre vonatkoztatva a képződött szkvalén nmól-ban kifejezett mennyiségét a következő képlettel számítjuk ki: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 „ , ,, „ „ szkvalén csúcs területe Szkvalén-5,0* —— ----;---------— dokozán csúcs területe •RR* (nmól/reakcióelegy) (a belső standard dokozán nmóljainak száma) *RR -a készülék érzékenységét dokozánra, illetve szkvalénra kifejező viszonyszám (dokozán/szkvalén), értéke: 0,56. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek vizsgálata A vegyületeket vízben oldjuk, és a famezil-difoszfát hozzáadását megelőzően adjuk a reakcióelegyhez. Minden egyes vegyületet különböző koncentrációkban, párhuzamos mérésekkel vizsgálunk. A párhuzamos mérések összesített eredményeiből megszerkesztjük a dózishatás-görbéket, amelyekből 95%-os megbízhatósági tartományban megállapítjuk az 50%-os gátlást okozó (I50) dózisokat. A találmány továbbá eljárás olyan gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek legalább egy (I) általános képletű vegyületet tartalmaznak hatóanyagként a gyógyszerészeiben használatos vivőanyagok és/vagy hígítószerek mellett. A gyógyszerkészítményeket a szokásos eljárásokkal, szilárd vagy folyékony vivőanyagok és/vagy hígítószerek, valamint az alkalmazási módnak megfelelő egyéb gyógyszerészeti segédanyagok felhasználásával állítjuk elő. A hatóanyagot emlősök szervezetébe - beleértve az ember, valamint majmot, kutyát és egyebeket - bejuttathatjuk szájon át, például tabletta, kapszula, granulátum vagy por formájában, vagy az emésztőrendszer megkerülésével, például injekciós készítmények formájában. Felnőtteknél a napi dózis előnyösen 200 és 2000 mg között van, amelyet egyetlen adagban, vagy 1-4 részre osztva adhatunk a páciensnek. Az alábbiakban példákat adunk meg a találmány szerinti eljárás előnyös kiviteli módjainak illusztrálására. Ha a példák szövegében másként nem áll, a hőmérsékletek mindig 'C-ban értendők. A végtermékeket több esetben is csak kromatográfiás úton sikerült tisztítani. E célra CHP20P gélt használtunk, amely egy rendkívül porózus sztirol-divinil-benzol-kopolimer - beszerezhető a Mitsubishi Chemical Industries cégtől -, és amelyet a szövegben röviden csak HP-20 néven említünk. A3'P-NMR-spektrumokat protonlecsatolásos üzemmódban vettük fel, külső standardként 85%-os foszforsavat (5-0 ppm) használtunk. A 19F-NMR- spektrumok felvételénél 1,1,1 -trifluor-2,2,2-triklóretánt (5-82,6 ppm) használtunk belső standardként. 1. példa (EJL)-{[Hidroxi-(4,8,12-trimetil-3,7,11 --tridekatrienil)-foszfinil]-metil}-foszfonsav trikáliumsója A) (E,E)-(3,7,11-Trimetil-2,6,10-dodekatrienil)-bromid 1,00 g (4,5 mmól) E^E-famezolt (Aldrich, flash-kromatográfiával továbbtisztított anyag) feloldunk 10 ml desztillált dietil-éterben, és argongáz alatt, 0 'C-on, fény4
