203887. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új kondenzált diazepinonok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 203 887 B 2 idegvégződéseken felszabaduló acetilkolin hatását. Az alábbiakban megadjuk azokat a módszereket, amelyekkel a kardioszelektív muszkarin antagonista hatás behatárolható. In vivo módszerek A vizsgálatok célja, hogy bizonyítsuk a muszkarin antagonista hatás szelektivitását Minden olyan hatóanyaggal, amelyet az in vitro tesztek alapján kiválasztottunk, elvégeztük az alábbi vizsgálatokat: 1. Mi/Mz szelektivitás patkányokon 2. Nyálelválasztást gátló hatás patkányokon 3. Az acetilkolin hólyagra, hörgőkre és szívfrekvenciára gyakorolt hatásának gátlása tengerimalacokon 1. Mi/M2 szelektivitás patkányokon A módszert Hammer és Giachetti [Life Science 31, 2991-2998 (1982)] írták le. A kísérletekhez hím, THOM patkányokat használtunk. A vizsgálati anyag növekvő dózisainak intravénás befecskendezését követően, 5 perc múlva, vagy a jobb oldali bolygóideget ingereltük elektromosan (frekvencia: 25 Hz; impulzusszélesség: 2 msec; időtartam: 30 sec; feszültség: szupramaximális), vagy McN-A-343 0,3 mg/kg dózisait kapták a kísérleti állatok intravénásán. Meghatároztuk a bolygóideg ingerlésével kiváltott bradikardiát, valamint az McN-343 okozta vérnyomás-emelkedést. A kísérleti vegyületnek azt a dózisát, amely a vagus ingerlésével kiváltott bradikardiát (M2), illetve a vérnyomás-emelkedés mértékét (Mi) 50%-kal csökkenti grafikusan állapítottuk meg. Az eredmények a 2. táblázatban találhatók. 2. Nyálelválasztást gátló hatás vizsgálata patkányokon A vizsgálatot Lavy és Mulder módszerével [Arch. Int Pharmacodyn. 178,437-445 (1969)] végeztük, miszerint 1,2 mg/kg metánnal altatott hím, THOM patkányoknak a vizsgálandó anyag növekvő dózisait adtuk intravénásán, majd a nyálfolyást 2 mg/kg pilokarpinnal váltottuk ki. A nyálat szűrőpapírral itattuk fel, és a kapott folt kiterjedését 5 percenként planiméterrel meghatároztuk. A kísérleti anyagnak azt a dózisát, amely a nyál térfogatát 50%-kal csökkenti, grafikusan állapítottuk meg. Az eredmények a 2. táblázatban találhatók. 3. Az acetilkolin hólyagra, hörgőkre és szívfrekvenciára gyakorolt hatásának gátlása tengerimalacokon Altatott tengerimalacoknak a vizsgálati anyag beadását követően 10 mg/kg acetilkolint adtunk mind intravénásán, mind intraartériásan egyidejűleg. A szívfrekvenciát testen kívüli elvezetéssel felvett elektrokardiogram segítségével, a légzési ellenállást Konzett- Rössler-módszerrel, a műtétileg feltárt húgyhólyag összehúzódását pedig közvetlenül regisztráltuk. A kapott eredmények alapján az acetilkolinnak a vizsgált szervekre gyakorolt hatását a kísérleti hatóanyagok gátolják. A gátlás mértékét a dózis függvényében ábrázolva meghatároztuk a -log EDjo értékeket, amelyeket a 3. táblázatban mutatunk be. C) Esetleges kölcsönhatások vizsgálata az imipramin, hisztamin-Hl és szerotonin-S2 receptorokkal Módszerek: a) Kötődési vizsgálatok imipramin receptorokon A vizsgálatokhoz 180-220 g testtömegű, hím, Sprague-Dawley patkányokat használtunk. Az agykérget kivettük és jéghideg TRIS-sósav pufferoldatban (pH-7,5; 50 mM TRIS, 5 mM kálium-klorid) egy Ultra-Turrax készülék segítségével homogenizáltuk. A homogenizátumot háromszor egymás után mostuk és 50 000 g-vel 10 percen át centrifugáltuk. Az üledéket a kiindulási tömegre számítva 1:125 arányban hígítottuk. A receptorkötődési vizsgálatokat úgy végeztük, hogy az így elkészített membrán- preparátum adott mennyiségéhez 1 nmól [3H] imipramint és a vizsgálandó anyag hígítási sort képező mennyiségeit adtuk, majd az elegyet 0 'C-on 60 percig inkubáltuk. Az inkubálás végeztével a mintát szívatással gyorsan szűrtük, és pufferoldattal végzett öblítés után a szűrő radioaktivitását mértük. A nemspecifikus kötődés mértékét a 100 pmól dezipramin jelenlétében végzett kísérlet során * mért radioaktivitásból kaptuk. Az ICjo értékeket grafikusan határoztuk meg. Az eredmények a 4. táblázatban találhatók. b) Kötődési vizsgálatok szerotonin-S2 receptorokon A vizsgálatokhoz, hasonlóan az imipramin receptorokon való kötődés vizsgálatához, agykéregsejteket használtunk. A homogenizálást TRIS-sósav pufferoldatban (50 mM TRIS, pH-7,7; 5,7 mM aszkorbinsav) Ultra-Turrax készülék segítségével végeztük. A homogenizátumot 50 000 g-vel centrifugáltuk, és az üledéket az agyszövet eredeti tömegére számítva 1:250 arányban hígítottuk. Az inkubációs oldat még 0,1 mM koncentrációban nialamidot is tartalmazott. Az inkubálást szobahőmérsékleten 0,3 nmól [3H] ketanszerinnel és a vizsgálandó vegyület hígítási sort képező mennyiségeivel végeztük 60 percen át, majd szívatással szintük a mintát, és mértük a szűrőn maradt radioaktivitást. A nemspecifikus kötődés mértékét úgy állapítottuk meg, hogy a kísérletet 3 (imól ketanszerin hozzáadásával végeztük. A kiértékelés az imipramin receptorokon való kötődés vizsgálatakor alkalmazott módszerrel történt. Az eredmények a 4. táblázatban találhatók. c) Kötődési vizsgálatok hisztamin-Hl receptorokon Ehhez a vizsgálathoz a kisagy kivételével az egész patkányagyat használtuk. A homogenizálást 7,5 pH-jú, Sörensen-féle foszfátpufferben, Ultra-Türrax készülék segítségével végeztük. A homogenizátumot kétszer mostuk és 50 000 g-vel centrifugáltuk. Az üledéket a kiindulási agy szövetre számítva 1:100 arányban hígítottuk. Az inkubálást szobahőmérsékleten, 2 nmól pirilaminnal és a vizsgálandó hatóanyag hígítási sort képező mennyiségeivel 60 percen át folytattuk, majd a mintát szűrtük, és a szűrőn maradt radioaktivitást mértük. A nemspecifikus 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
