203827. lajstromszámú szabadalom • Eljárás transzplantálható, in vitro tenyésztett epitélium-lemezkék konzerválására
1 HU 203 827 B 2 lium-lemezkét mutatjuk be a találmány szerinti eljárással végzett kezelés és felengedés után optikai mikrofotográfián, a 2. ábrán az lb. ábrán szereplő tenyésztett epitélium-lemezke elektronmikroszkóppal készített felvételét mutatjuk be. A találmány szerinti eljárásnál olyan epitéliumfílm lemezkéket és hasonlói«« használtunk, amelyeket a 4 016 036, a 4 304 866 és a 4 456 657. számú - korábban már említett - amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások szerint lehet előállítani, ezeket a szabadalmakat tehát jelen találmányunk kifejezetten magában foglalja. A lemezeket először stabilizáljuk olymódon, hogy azokat egy kriokonzerválószert tartalmazó közegben, előnyösen Dulbecco-féle tápközeget tartalmazó közegben inkubáljuk. Az intracelluláris kriokonzerválószer koncentrációja az eljárás sikere szempontjából lényeges tényező. Előnyösen 8-15 tömeg% kriokonzerválószert alkalmazunk, amely előnyösen glicerin vagy dimetil-szulfoxid. Még előnyösebben 10 tömeg% glicerint alkalmazunk kriokonzerválószerként. A lemezeket szobahőmérsékleten inkubáljuk, előnyösen 15 percnél rövidebb ideig. Azt találtuk, hogy az inkubációs idő bizonyos szempontból kritikus, mivel megállapítottuk, hogy az ilyen időtartam meghatározó mértékben hat a sejt életképességére és az átültetett keratinociták telepképző képességére. A különböző hosszúságú inkubációs időkkel végzett kísérletek azt mutatták, hogy a keratinociták telepképző képessége lényegesen csökken mind nagyon rövid inkubációs idők (2 percnél rövidebb idők), mind hosszú inkubációs idők (15 percnél hosszabb idők) esetén, míg a telepképző képesség Nagymértékben megnövekszik 4-7 perc közötti idők esetén, és 5-7 perc között maximumot ér el. A kriokonzerválőszerből ekvivalens intracelluláris koncentrációt tudunk bevinni a sejtekbe, ha nagyobb koncentrációkat és rövidebb inkubációs időtartalmokat alkalmazunk, vagy kisebb koncentrációkat hosszabb inkubációs idő mellett Az inkubációs után az epitélium-lemezkéket hűtési eljárásnak vetjük alá, amely közben a hőmérsékletet szigorúan szabályozzuk olymódon, hogy a hőmérsékletesés az eljárás elején kisebb, mint az eljárás végén. A lassabb hűtési grádienst, lassabbat, mint -2 *C/perc, előnyösen lassabbat, mint -1 *C/perc, alkalmazzuk a 0 "C közvetlen környezetében, vagyis közvetlenül 0 'C felett, a 0 *C áthaladása alatt és a 0 "C alatt. A fagyáspont alatt a további hűtést már gyorsabban is lehet végezni. Előnyös, ha a hűtést felfüggesztjük néhány percre, mielőtt a sejtek a fagyáspont alá hűlnének. A hűtés végén a már fagyasztott lemezkéket előnyösen legalább -80 °C hőmérsékletig, még előnyösebben legalább -100 ‘C hőmérsékletig hűtjük. Különösen előnyös a következő fagyasztási program: kiindulási hőmérséklet: +25 ’C -5 'C/perc-3 *C-ig szünet 4 percig, -1 'C/perc-7 'C-ig -25 'C/perc-40 *C-ig +15 “C/perc-25 'C-ig-2 ‘C/perc-40 'C-ig-3 ”C/perc-100 'C-ig. Ebben az állapotban a kezelt epitélium-lemezkéket legalább három hónapig lehet tárolni anélkül, hogy morfológiai és funkciós jellemzői lényegesen megváltoznának. Valójában a találmány szerinti kezeléssel előállított epitélium-lemezkék mind morfológiai, mind átültethetőségi szempontból összemérhetők azokkal, amelyeket egyébként friss tenyészetekből hűtéssel végzett konzerválás nélkül lehet előállítani. A lemezkéket előnyösen egyik oldalukon egy nem tapadó, előzetesen lefagyasztott hordozóanyagra visszük. Vazelinnel kezelt steril hagyományos géz nagyon alkalmas erre a célra. A hordozóanyag megkönnyíti a műveleteket a törékeny lemezkékkel, mind fagyott állapotban, mind felengedés után. A hordozó ezen kívül hagyományos, ideiglenes fedőanyagként is szolgál a lemez számára, a sérült bőrfelületre történt alkalmazás után. Az la. ábrán mutatjuk be a lemezkét a találmány szerinti eljárással végzett kezelés előtt, míg az lb. ábrán azt a lemezkét mutatjuk be, amelyet a találmány szerinti hűtési eljárással már kezeltünk, felengedés után. Az lb. ábrán bemutatott lemezke tehát kész arra, hogy transzplantátumként használjuk. Műid az la. mind az lb. ábrán szereplő lemezkéket fixáltuk, vágtuk és hematoxilin eozinnal festettük. A 2. ábrán az in vitro tenyésztett, 1. ábrán bemutatott, epidermális lemezke elektronmikrofotográfíáját mutatjuk be. Ezekből a mikrofotográfiákból nyilvánvalóan kitűnik, hogy a találmány szerinti eljárással jó eredmény érhető el mind az alsó réteg sejtkonzerválása, mind az intercelluláris szerkezet konzerválása szempontjából. A kezelt lemezek felhasználásakor elegendő, ha azokat néhány percig 37 *C-on inkubáljuk, majd fiziológiás sóoldattal vagy megfelelő tápközeggel mossuk. Az égett felületek fedésén kívül a konzervált epidermisz lemezkék egyéb területeken is hatékonyan felhasználhatók, például onkológiai, plasztikai vagy rekonstruktív sebészetben. A konzervált, in vitro tenyésztett nyálkahártya szintén felhasználható a szájsebészetben. A következőkben a találmány szerinti eljárás egyik előnyös megvalósítását mutatjuk be egy példában, ezzel azonban nem szándékozunk a találmány oltalmi körét korlátozni. Példa A keratinocita tenyészetet a fent említett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások szerint állítjuk elő. Közelebbről a 4 016 036 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint előállított egybefolyó, szekunder keratinocita tenyészetet használjuk, amelyet leválasztunk a tenyésztő üvegéből, vazelinnel bevont gézre visszük és ott fém érsebészeti csipesszel rögzítjük a 4 304 866 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett módszerrel. Ezeket a tenyésztett szövetdarabokat ezután steril 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
