203827. lajstromszámú szabadalom • Eljárás transzplantálható, in vitro tenyésztett epitélium-lemezkék konzerválására
1 HU 203 827 B 2 körülmények között 12 x 20-as steril poliészter/poüetilén/alumínium zacskókba tesszük át (a zacskók a Gambro S.A. 18, Rue de Calais, 75885 Paris cég termékei), egy zacskóba három transzplantátumot helyezünk, ezután 100 ml tápközeget adunk a zacskókba. A tápközeg összetétele a kővetkező: Dulbeco által módosított Eagle tápközeg 541% Ham-féle F12 271% Boíjú magzati szérum (FCS) 91% Glicerin 101% Glutamin 4 mM Adenin l,8x 10'4M Inzulin 5 mcg/ml Transzferrin 5 mcg/ml Trijód-tironin 2x 10'9 M Hidrokortizon 0,4 mcg/ml Epidermális növekedési faktor 10ng/ml Penicillin-sztreptomicin 50U/ml. A zsákokat ezután termikusán lezárjuk és szobahőmérsékleten 5-7 percig inkubéljuk. A zacskókat ezután megfelelő konténerbe helyezzük és így tesszük egy alkalmas programozható fagyasztóládába (egy ilyen fagyasztóláda Programozható Hőmérsékletszabályozó PTC-300 néven ismeretes és kereskedelmi forgalomban is kapható a Planer Products Ltd. cégnél). A szövetdarabokat ezután a következő fagyasztási program szerint fagyasztjuk: kiindulási hőmérséklet +25 ‘C -5 ‘C/perc+3 *C-ig szünet 4 percig,-1 ‘C/perc-7 ‘C-ig -25 *C/perc-40 'C-ig +15 ‘C/perc-25 ’C-ig -2 °C/perc-40 *C-ig és -3 *C/j>erc-100 *C-ig. Amikor a végső hőmérsékletet, a -100 *C-ot eléljük, a műanyag zacskókat megfelelő fémkonténerbe helyezzük, amelyet előzetesen -80 *C hőmérsékletűre hűtöttünk legalább 2 órával korábban. A fémkonténert ezután gyorsan behelyezzük egy -80 *C-os fagyasztóládába. A fagyasztott epitélium-lemezkéket tartalmzó zacskókat hosszabb távolságra is el lehet szállítani, az egyedüli feltétel, hogy a hőmérsékletnövekedéseket el kell közben kerülni. A fagyasztott lemezéket -80 ‘C-on legalább 3 hónapig lehet tárolni. Ez alatt az idő alatt megőrzik morfológiai és funkcionális jellemző tulajdonságaikat. Amikor a fagyasztott filmeket fel kell használni, akkor a zacskókat kivesszük a fagyasztóládából, azonnal 37 ‘C-os vízfürdőbe helyezzük és 10 percig ezen a hőmérsékleten tartjuk. A zacskókat ezután néhány másodpercre 70%-os etanolba merítjük. Ezután nyitjuk ki steril körülmények között a zacskókat, kivesszük az epitélium-lemezkéket, azokat steril edényekbe helyezzük és gondosan mossuk tápközeggel vagy fiziológiás sóoldattal és felhasználjuk. A felhasználás során a sebet hagyományos módon készítjük elő annak érdekében, hogy a felengedett lemezkék sejtjei számára az a közvetlen érintkezéshez megfelelő szubsztrátum legyen. A lemezkéket úgy alkalmazzuk, hogy azokat felület-a-felülethez érintkezésben a sérült felületre helyezzük, a hordozóanyagot tesszük kívülre, és ezután a lemezkéket a hordozóanyagon keresztül enyhén megnyomogatjuk, hogy az pontosan a sérült felület alakjában megfelelő legyen. Nagyobb felületek esetén több lemezkét alkalmazunk. Az ismertetett eljárásban a szakember természetesen különféle módosításokat hajthat végre, az ilyen módosítások véleményünk szerint találmányunk oltalmi körébe tartoznak. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás epitélium-lemezkék konzerválására, azzal jel lemezve,hogy i) in vitro tenyésztett epitélium-lemezkéket szobahőmérsékleten, kriokonzerválószert tartalmazó közegben 2-15 percig inkubálunk, majd ii) ezeket az epitélium-lemezeket legalább -80 ‘C-on lefagyasztjuk, oly módon, hogy a 0 ‘C környezetében legfeljebb -2 *C/perc hűtési sebességgel hűtjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kriokionzerválószerként glicerint vagy dimetilszulfoxidot alkalmazunk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 8-15 tömeg% kriokonzerválószert adagolunk a tápközeghez. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inkubáiást szobahőmérsékleten 4-7 percig végezzük. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j el lemezve, hogy közegként az alábbi összetételű tápközeget alkalmazzuk: Dulbecco által módosított Eagle tápközeg 541% Ham-féle F12 271% Borjú magzati szérum 91% Glicerin 101% Glutamin 4 mM Adenin 1,8x10^ M Inzulin 5 pg/ml Transzferrin 5 pg/ml Trijód-tironin 2xl0'9 M Hidrokortizon 0,4 pg/ml Epidermális növekedési faktor 10 ngAnl Penicillin-sztreptomicin 50U/ml. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő fagyasztási programot alkalmazunk: Kiindulási hőmérséklet: +25 *C -5 ‘C/perc+3 *C-ig szünet 4 percig, -1 ‘C/perc-7 ‘C-ig -25 ‘C/perc-40 ‘C-ig +15 'C/perc-25 ‘C-ig -2 ‘C/perc-40 *C-ig -3 *C/perc-100 ‘C-ig. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal /«//«nezve,hogy epitélium tenyészetként keratinocita tenyészetet alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
