203827. lajstromszámú szabadalom • Eljárás transzplantálható, in vitro tenyésztett epitélium-lemezkék konzerválására
1 HU 203 827 B 2 zerválás után mitózisra képesek. Tehát a lemezek erre a felhasználásra csak akkor rendelkeznek megfelelő biológiai tulajdonságokkal, ha képsek mitózisra és rétegelt differenciálódásra. Ezt a képességet mind ezideig nem sikerült kimutatni a fagyasztót«, majd felengedett, tenyésztett epitélium-mintákban. A fagyasztás és felengedés hatását a sejtek pusztulására tenyésztett, egybefolyó lemezekben, amelyeknek nincs hordozó bőranyaguk, nem lehet biztonságosan elére megjósolni. A lemezek olyan sejtekből állnak, amelyeket a felületi fehérjék kapcsolnak össze és mindössze néhány sejt vastagságúak. Nem differenciálódnak teljesen rétegelt epidermisz formájában. A fagyasztás és a felengedés sejten belüli és sejtek közötti jégkristály képződéssel jár, valamint expanzióval és kontrakcióval, és mindezek előre meg nem jósolható hatást gyakorolnak az egyedi tenyésztett sejtdere és a lemezkékre mint egészre. Előnyös volna tehát fagyasztott tenyésztett bőrtranszplantátumok előállítása, mivel ezeket tárolni és szállítani lehet. Ez igen előnyös volna azon betegek számára, akik több transzplantációt igényelnek, mivel ez jobban összehangolhatóvá tenné a tenyésztést és a sebészeti beavatkozást A feladat megoldásával lehetségessé válna az úgynevezett „szövetbankok” kialakítása vagy egyéb olyan raktárak létrehozása, amelyek allogén expandált epidermiszt tárolnak, és amelyek szükség esetén igénybevehetők. A fagyott állapotban azonnal rendelkezésre álló tenyésztett allotranszplantátumoknak számos klinikai alkalmazásuk lehetséges. Például azt találtuk, hogy súlyos másodfolú égési sérülések sokkal gyorsabban gyógyulnak, ha tenyésztett allotranszplantátumokba ültetik át őket. Korlátozott, a bőrt teljes vastagságában ért sérülések, amelyek künikailag harmadfokú égésekként jelentkezhetnek, újry hámosíthatók voltak a recipiens keratinocitáival, amelyek növekedését és valószínűleg migrációját erősen stimulálta a tenyésztett allotranszplantátum. A tenyésztett allotranszplantátumok többnyire felhasználhatók voltak, a vastagságban hasított meshtranszplantációknál használt donor helyeknél. Az eredmény az ilyen felületek szép gyógyulása már 4 nap után is. Az ismertetett eljárás sikeresen használható in vitro tenyésztett nyálkahártya hűtéssel történő konzerválására is. Ezzel kapcsolatban megállapítottuk, hogy tenyésztett nyálkahártyát in vitro elő lehet állítani egy foggyökérhúzó műszerrel vett biopsziálból kiindulva ugyanazzal a módszerrel, mint amelyet a bőr keratinicitából kiinduló epitélium-film előállítására írtak le. Azt is tapasztaltuk, hogy az in vitro tenyésztett nyálkahártya sikeresen transzplantálható olyan betegekbe, akiknek orális nyálkahártya-transzplantációra van szükségük. A találmány szerint előállított tenyésztett, hűtéssel konzervált hámlemezkék felengedés után állandó autotranszplantátumként vagy ideiglenes, jól gyógyuló allotranszplantátumként használhatók fel. Ezek felhasználásával bizonyos bőrsérülések nagyon jól kezelhetők. A találmány körébe tartozik olyan eljárás kidolgozása is, amely lehetővé teszi a tenyésztett bőrlemezkék szövetbankokban való tárolását, elosztását és ezt követő megfelelő alkalmazását olyan formában, amely megkönnyíti az orvos munkáját és amely hatékonyan felhasználható égési sérülések, fekélyek és egyéb sérülések kezelésénél. Ugyancsak a találmány körébe tartozik olyan stabilizált epitélium tenyészetek tárolása, amelyek mitózisra és rétegelt differenciálódásra képesek, permanens autó transzplantáció vagy ideiglenes allotranszplantáció elvégzéséhez. A találmányunk lényegét a következő leírásban rajzzal és igénypontokban világítjuk meg. A találmány tárgya eljárás in vitro tenyésztett egybefolyó hámsejtekből álló transzplantálható epitélium-lemezkék konzerválására, amely abból áll, hogy a) in vitro tenyésztett epitélium-lemezkéket szobahőmérsékleten, kriokonzerválószert tartalmazó közegben 2-15 percig inkubálunk, majd ii) ezeket az epitélium-lemezeket legalább -80 'C-on lefogyasztjuk, oly módon, hogy a 0 ’C környezetében legfeljebb -2 °C/pcrc hűtési sebességgel hűtjük. Előnyösen a lemezkék tenyésztett, egybefolyó keraúnocita sejtekből állnak, még előnyösebben epidermális keratinodtákból. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi a konzervált, tenyésztett epidermisz szállítását és ezáltal a hűtéssel konzervált tenyésztett allogén epidermiszbank létrehozását. A találmány szerinti eljárásnál a tenyésztett hámlemezkéket, amelyet egyébként transzplantálásra alkalmasak, olyan közegben inkubáljuk, amely hagyományos tápanyagot és egy kriokonzerválószert tartalmaz. A lemezkéket először egy előre meghatározott időtartamon keresztül inkubáljuk, majd ezután hűtjük le a végső kb. -100 "C-os hőmérsékletre. Az alkalmazott hűtési grádiens a kezdeti fázisban lassabb, a végső fázisban gyorsabb. Az eljárással egy szállításra alkalmas stabilizált epitélium-sebellátó készítmény állítható elő, amely egy fagyasztott, egybefolyó, tenyésztett hámsejtekből álló lemezből áll, amely egy nemtapadó hordozóra van felvive. Felengedés után, amikor egy seb felületére alkalmazzák, az előállított sejtlemezke metabolikus szempontból megfelelő, mitózisra és rétegelt differenciálódásra alkalmas, így permanens autotranszplantációhoz vagy ideiglenes allotranszplantációhoz használható. Ez azt jelenti, hogy ha a lemezkék a páciensből származó hámsejtekből készültek, akkor alkalmazásuk állandó autotranszplantációt eredményez. Az ilyen humán hámsejtekből tenyésztett lemezek más humán pácienseknél történő alkalmazás esetén kitűnő, metabolikus szempontból megfelelő, jól gyógyuló, ideiglenes allotranszplantációt tesznek lehetővé. A találmány szerinti eljárással előállított lemezeket rajzon is bemutatjuk. Az la. ábrán egy tenyésztett, humán epitélium-lemezkét mutatunk be optikai mikrofotogiáfián, a találmány szerinti eljárással történő kezelés előtt, az lb. ábrán az la. ábrán bemutatott tenyésztett epitá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
