203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
i 1 HU 203 795 B 2 A „core”-rész további csonkítása, mely az E próba 6 bázispáros ismétlődó egységhez vezet, teljesen megváltoztatta a próbával kapott DNS-ujjlenyomat-mintázatokat, s az azonosított mintázat nagyban megegyezett a vizsgált személyeknél (vagyis az azonosított fragmentumok nem mutattak extrém polimorfikus variációt). Az E jelű próbánál a „core”-szekvencia tehát feltehetően nem annyira megfelelő DNS-ujjlenyomat-analízishez, mint a korábban használt 33.5, 33.6 és 33.15 hibridizációs próbák „core”-szekvenciái. Ez arra utal, hogy a „core"-szekvencia hosszának praktikus alsó határa 7 bázispár, amely még általánosan alkalmas lehet 5 DNS-ujjlenyomat-analízishez. A „core” központi, legállandóbb részének szétdarabolásával kapott Ml3.core F „core” alkalmazása szintén csökkentette a DNS- ujjlenyomatmintázat komplex és variábilis jellegét. 5. táblázat A hat mesterséges miniszatellit-próba (M13.core A-F) jellemzése bp ismétlődések irányultság %-os homologicitás száma megjegyzés A core GGAGGTGGGCAGGA G 16 100 33.6 (a)aGGGCtGGAGG 11 (12) 3*18 f(82) 33.15 aGAGGTGGGCAGGtGG 16 29 <r(87,5) 33.5 gGGAGGTGGGCAGGAGG 17 14 <(91) M13.core A TGGGCtGG 8 50-» 87,5 Chl M13.core B GTGGGCAGGAAG 12 7 «-100 rövid „core” M13.core C TGGGCAG 7 47-» 100 nagyon rövid „core” Ml 3.core D GGTGGGCAGGtGG 13 5 «-92 rövid 33.15 Ml 3.core E aGGGCA 6 34 83 nagyon rövid 33.6/33.15 hibrid Ml 3.core F AGG caGG tAGGtGG 14 9 <-71 rövid 33.15, TGGGCA megszakítva Az Ml3.core A („poli-Chi”) alkalmazása új és intenzíven hibridzáló DNS-fragmentum mintázatot eredményez. Sok igen nagy és kevéssé elválasztható fragmentumot kaptunk (>15 kilobázis), melyek feltehetően egy 40 szokásos hosszú - Hinfl hasítóhelyet véletlenszerűen tartalmazó - szatellit-szekvenciából származnak. Az azonosított DNS-fragmentumok egy része egyénre jellemző variabilitást mutatott 45 17. példa Az A „core" további vizsgálata Az M13.core A hibridizációs próbával nyerhető mintázatokat tovább analizáltuk a neurofibromatózissal terhelt család segítségével, mely családot részlete- 50 sen vizsgáltunk a 33.6 és a 33.15 próbákkal (lásd 8. példa és 7. ábra). A 12. ábra bemutatja a apától (F), hat lányától (D) és öt fiától (S) származó, Hinfl enzimmel emészetett DNS-ből kapott ujjlenyomatokat Az autoszomális eredetű, dominánsan öröklődő betegséggel - 55 a neurofibromatózissal - terhelt egyéneket + jellel láttuk el. A beteg anya DNS-e nem volt hozzáférhető. A szegregálódott apai eredetű csíkokat • -val, az anyaiakat o -val jelöltük. A folyamatos vonallal összekötöttek kapcsolt módon, a pontozott vonallal összekötöttek pe- 60 dig allelikus módon szegregálódtak. Az x-szel jelölt csíkokat már korábban detektáltuk a 33.15 próbával. Eredmények Eltérően a 33.6 és 33.15 próbákkal nyert ujjlenyomatoktól, a viriabilitás foka viszonylagosan kicsi, mivel sok fragment átadódott valamennyi utódnak (vagyis ezek a fragmentek közösek, nem ritkák a populációban, gyakorta előfordulnak homozigótaként). Hat apai eredetű és kilenc anyai eredetű heterozigótacsík szegregációját tudtuk azonosítani a 11 gyereknél. Egyik apai eredetű csíkot és az egyik anyai eredetű allelikus párt már korábban detektáltuk a 33.15 próbával. A kapcsolt és alléi párok elhagyása után 2 új apai és 6 új anyai eredetű lókusz maradt, amelyeket a 33.6 és 33.15 hibridizációs próbák nem mutattak ki, összehasonlítva a korábban azonosított 34 apai és 25 anyai eredetű lókusszal. így a „poli-Chi”-próba csak korlátozottan alkalmas humán genetikai analízisre. A16. és 17. példák eredményei kiemelik a korábban tárgyalt 5. táblázat felső sorában aláhúzott kilenc domináns nukleotid jelentőségét. Ezek a példák segítették annak - a leíró részben említett - feltételezésnek a bizonyítását is, mely szerint minimálisan 6 nukleotidos 24
