203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 séget tenni különböző DNS-minták között több különböző miniszatellit, vagy hipervariábilis lókusz alapján, s ez az a felfedezés, amely a találmányt szokatlan mértékben újszerűvé és fontossá teszi, valamint alapvető tudományos újdonsággal ruházza fel. Az ún. „core”-szekvencia ismerete lehetővé teszi, hogy olyan DNS-hibridizációs próbákat állítsunk elő, melyek egyidejűleg képesek hibridizálni a genom több különböző lőkuszából származó miniszatellit-régiókkal. Mindazáltal a „core”-szekvencia felismerése és azonosítása önmagában nem elegendő egy jól használható hibridizációs próba előállításához. Ehhez az is szükséges, hogy olyan polinukleotidokat állítsunk elő, amelyek a „core”-szekvenciának vagy származékainak tandemismétlődéseit tartalmazzák. Ilyen hibridizációs próbákhoz juthatunk humán vagy állati DNS miniszatellit-régiőinak izolálása által, de szintetikusan is előállíthatjuk azokat. Az is fontos, hogy ismerjük azokat a járulékos feltételeket, melyek a hibridizációs kísérletek sikerét befolyásolhatják. Szükséges például ismernünk, hogy milyen mértékű homológiát kell mutatnia a hibridizációs próba ismétlődő egységének a konszenzus„core”-szekvenciával, valamint azt is, hogy milyen hosszú „nem-core”-szekvenciarészlet fordulhat elő a hibridizációs próba ismétlődő egységében, akár a „core”-szekvenciába ékelődve, akár azt szegélyezve. A találmány tehát magában foglalja azon felismeréseket, (1) hogy bármely „core”-szekvencia ismerete a fent leírt módon hasznosítható, ezen belül (2) a genom különböző hipervariábilis lókuszainak vizsgálata során különböző „core”-szekvenciákat találhatunk, amelyek bizonyos, meghatározott mértékű homológiát mutatnak egy elméletileg megadható konszenzus-„core”-szekvenciával; (3) előállítható DNS-hibridizációs próbáknak egy olyan családja, melynek minden tagja különböző polimorfizmus-spektrumot ismer fel egy adott genomban; (4) egy bizonyos szempont szerinti genetikai osztályozásra a különböző hibridizációs próbák különböző mértékben alkalmasak; (5) amennyiben bármely szempont szerinti genetikai osztályozáshoz egynél több hibridizációs próbát alkalmazunk, az azonosítás valószínűsége megnő; (6) a sikerrel alkalmazható hibridizációs próbák első generációjának további tanulmányozása által egyszerűbb és jobban használható hibridizációs próbák állíthatóak elő, például szintetikus úton. A találmány tárgya tehát egyrészt egy olyan eljárás, melynek segítségével polimorfikus, miniszatellithosszspecifikus kötési sajátosságokkal rendelkező polinukleotid hibridizációs próbákat állíthatunk elő. Az eljárás a következő főbb lépéseket foglalja magában: a) természetes, tandemismétlődést mutató DNS- szekvencia azonosítása, amely kis mértékben hibridizálni képes más polimorfikus DNS-régiókhoz, b) a kismértékű hibridizációért feltehetően felelős, természetes konszenzus-„core”-szekvencia azonosítása az ismétlődő egységen belül c) olyan, a természetes konszenzus-„core”-szekvenciából származó, tökéletes vagy nem tökéletes tandemismétlődéseket tartalmazó polinukleotid hibridizációs próbák izolálása vagy mesterséges felépítése, melyek miniszatellitkötő képessége kisebb genomlókusz-specifitást és nagyobb polimorfikus fragmentumtűrést mutat, mint a természetes ismétlődő szekvenciáé. A hibridizációs próba „core”-szekvenciáját többféle definícióval is meg lehet határozni bizonyos alapvető irányelvek alapján. A legfontosabb ilyen alapelv az, hogy a hibridizációs próba ismétlődő egysége részben vagy egészében tartalmazzon egy közös „core”-régiót, amely megtalálható az emberi vagy állati genomi DNS különböző miniszatellit-régióban. A közös „core”-régió abban az értelemben „közös”, hogy a különböző miniszatellitekben található „core”-részletek nagy mértékben konszenzus (azaz megegyező) szekvenciák, például legalább 80%-os homológia van közöttük. Ezek a miniszatellit-régiók kimutathatóak például úgy, hogy a genomi DNS-fragmentumokat a mioglobingén 33 bázispáros ismétlődő szekvenciájával hibridizáltatjuk. Az ily módon hibridizáló fragmentumokat a leírásban „A33 pozitív” fragmentumoknak nevezzük. Ezek a fragmentumok és a mioglobingén 33 bázispáros ismétlődő egysége kb. 16 bázispár hosszú közös „core”szekvenciát tartalmaznak. A A3 3 pozitív fragmentumok maguk is használhatók hibridizációs próbaként, és amennyiben ezeket genomi DNS-hez hibridizáltatjuk, újabb olyan fragmentumokat azonosíthatunk, melyek szintén tartalmazzák a közös „core”-szekvenciát, bár lehetséges hogy kisebb-nagyobb eltéréssel. Egy másik alapelv az, hogy a „core”-nukleotid-szekvenciarészlet nem lehet olyan rövid, hogy ne hibridizáljon hatékonyan a minta-DNS miniszatellit-régióihoz, de olyan hosszú sem lehet, hogy ne mutassa jól ki a polimorfizmusokat Ez például akkor fordul elő, ha a próba túlságosan hasonló a mioglobingén 33 bázispáros tandemismétlődéseket tartalmazó szakaszához. Általánosan: a „core”-szekvencia hossza 6 bázispártól 16 bázispárig kell hogy terjedjen, mivel a miniszatellit-régiók közös „core”-szekvenciája maximálisan kb. 16 bázispár hosszú. A hibridizációs próba ismétlődő egysége nem szükséges, hogy teljes egészében tartalmazza a közös „core”-szekvenciát, és tartalmazhat szegélyező „fanking” nukleotidokat a „core”-szekvenciarészlet mindkét oldalán. Nem szükséges, hogy az ismétlődő egységek egy hibridizációs próbán belül tökéletesen azonosak legyenek, lehetnek kis különbségek az égységek között mind a bázispárok számában, mind azok milyenségében, a „core”- és „nem-core”-szekvenciarészletekben egyaránt. Az egyszerűség szempontjából mégis célszerű az egységeket ismétlődő egységeknek nevezni, megjegyezve azonban, hogy ez csak megközelítő meghatározás. Egy n darab ismétlődő egységet tartalmazó szekvenciarészletet mindkét oldaláról szegélyezhet bármilyen nukleotidszekvencia, s a szegélyezőszekvenciák mérete és milyensége általában lényegtelen. A találmány szerinti polinukleotidok a következő definíciók bármelyikével megadhatóak: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
