203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 A hipervariábilis fragmentumok (7. ábra) átadódási gyakorisága tanulmányozásának céljából, a 33.6 és 33.15 jelű hibridizációs próbák által azonosított n darab fragmentum közül azoknak a számát, melyeket a 11 utód közül pontosan r darab örökölt, összevetettük a binominális eloszlás alapján számítható várható érték-50% átadődást feltételezve (4. táblázat). Azok a fragmentumok, amelyek minden utódnál megtalálhatóak, feltehetőén homozigóta-lókuszokból származnak, így ezeket figyelmen kívül hagytuk. Azokat az anyai fragmentumokat, amelyek egyik gyermeknek sem adódtak át, nem tudtuk azonosítani, mivel anyai DNS-minta nem állt rendelkezésünkre. A táblázatban feltüntettük az átlagos átadódási gyakoriságokat (-S.E.M.) is. Az AB fragmentumpárok közötti kapcsoltságot úgy vizsgáltuk, hogy megszámoltuk, hogy hány leszármazottnál öröklődött kapcsoltan az AB pár (AB vagy —), minden lehetséges apai-anyai fragmentumpárosítást figyelembe véve; először a kizárt alléleket majd a csatolt sávokat vettük számításba (eszerint minden szülő esetén a darab lókuszt lásd 3. táblázat, s így c(c-l) 2 különböző párt vizsgáltunk). Azok a fragmentumpárok, amelyek sorrendben 0, illetve 11 utódnak adódtak át, alléleket, illetve szoros kapcsoltságban öröklődő párokat jelentenek, a definíció értelmében tehát egy pár sem esik ezekbe a kategóriákba. A megfigyelt megoszlást egyrészt összehasonlítottuk azzal a várható értékkel, amit akkor kapnánk, ha mind a c darab lókusz függetlenül öröklődne (U). Ebben az esetben azoknak a pároknak a számát, melyekre nézve pontosan r darab (AB vagy —) utód van, a binominális eloszlás alapján a következő módon kaphatjuk meg: 11Cr c(c—1) 211 * 2 A megfigyelt megoszlást oly módon számított várható értékkel is összevetettük, ahol a c darab lókusz egymástól egyenlő távolságra lévő klaszterekbe kapcsoltan öröklődik, ahol a szomszédos lókuszokat egymástól 0 rekombinációs gyakoriság választja el (0-10,20 vagy 30 cM). A klaszter ily módon (c-l)’1' térképegységgel fog szétterjedni, ahol V--1/2 1 n (1-20). Ily módon azoknak a pároknak a számát, melyekre nézve c darab lókuszt figyelembe véve (véletlenszerűen az egyik, illetve másik alléiból mintát véve), pontosan r darab (AB vagy—) utód van, 11 utód esetén, a következő képlet adja meg: ahol Xi az egymástól i térkép egység távolságra lévő lókusz rekombinációs hányadosa; Xi a térkép függvény alapján számítható: Xi- ^ (l-e'^O Eredmények DNS-ujjlenyomatkészítő hiridizációs próbák Az ebben a példában használt két miniszatellit-hibridizációs próbát a bejelentés fő részében már pontosan ismertettük. A 33.15 jelű hibridizációs próba egy klónozott humán miniszatellit-régiót tartalmaz, amely a „core”szekvencia egy 16 bázispáros variánsának 29-szeres ismétlődéséből áll. A 33.6 jelű hibridizációs próba ismétlődő egysége egy nem teljesen szabályos trimer, amely a „core”-szekvencia leginkább konzervált 3 ’ végi 11 bázispáros részletének háromszoros ismétlődése, s ez az egység ismédődik 18-szor. A következőkben megadjuk a „core” és a hibridizációs próbák isméüődő egységeinek szekvenciáit: A A core GGAGGTGGGCAGGAGG 33.15 AGAGGTGGGCAGGTGG 33.16 AGGGCTGGAGG Mivel a 33.6 és a 33.15 jelű hibridizációs próbák mind szekvenciájukban, mind az ismétlődő egységek hosszában különböznek, a Hinfl enzimmel emésztett humán DNS-ben különböző hosszú hipervariábilis miniszatellit-fragmentumokat detektálnak, s így egymástól különböző mintázatot adnak. A Hinfl restrikciós endonukleáz felismerőhelye 4 bp hosszúságú, s így használata rendkívül megnöveli a módszer feloldóképességét, mivel emésztéskor olyan fragmentumok ke- - letkeznek, melyeken a hosszú tandemismédődésekettartalmazó miniszatellit-régió mellett kevés kísérőszek- v vencia található. A DNS-ujjlenyomatok vizsgálata egy nagy családon belül A különböző miniszatellit-fragmentumok szegregációjának megfigyelése érdekében 11 angol nemezetiségű testvéren és édeapjukon végeztünk vizsgálatokat, a családban a neurofibromatózis öröklődését kísértük figyelemmel. A neurofibromatózis (von Recklinghausen kór) egy autoszomális, domináns rendellenesség, amely a perifériás és centrális idegrendszer daganatos megbetegedésével jár együtt. Mind ez ideig semmilyen genetikai markért nem találtak, ami a betegséggel kapcsoltan öröklődne. All gyermek (6 beteg és 5 egészséges) véréből, a 33.6 és 33.15 jelű hibridizációs próbák segítségével készített DNS-ujjlenyomatokat összehasonlítottuk egészséges édesapjuk hasonlóan készített DNS-ujjlenyomatával (7. ábra). A miniszatellit-DNS-fragmentumok lehető legjobb szétválasztását 35 cm hosszú agarózgélben történő elektroforézissel biztosítottuk. Mivel a hipervariábilis miniszatellitek közül - a várakozásnak megfelelően - sok kis allélgyakoriságú (különösen a legnagyobb fragmentumok), és megoszlásuk rokonságban nem álló személyek között véletlenszerű, ezek közül a fragmentumok közül sok heterozigóta formában van jelen a neurofibromatózist hordozó családban, ezért ezek a fragmentumok csak a leszármazottak egy részének adódtak át. Bár a beteg édesanya DNS-e nem volt hozzáférhető, mégis könnyen azono-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 19
