203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 síthattunk olyan anyai eredetű miniszatellit-ffagmentumokat, melyek több utódban jelen vannak, de az édesapából hiányoznak. Hasonlóképpen tudtuk azonosítani az apai eredeti fragmentumokat is. A 33.6 és 33.15 jelű hibridizációs próbákat egyaránt felhasználva 41 apai eredetű és 32 anyai eredetű DNS-fragment szegregációját tudtuk az utódok között kimutatni (7. ábra, 3. táblázat). Ennél jóval több polimorf fragment létezik, de ezek vagy kifutottak a gélből az elektroforézis során, vagy nem tökéletesen váltak szét egymástól, s ezért nehezen azonosíthatóak. A heterozigóta apai eredetű DNS-ffagmentumok átlagosan 53%-ban adódtak át az udódoknak. Az anyai eredetű fragmentumok hasonló mértékben, 48%-osan adódtak át, ami megfelel az 1:1 arányú megoszlásnak (lásd 4. táblázat). Továbbá azon gyerekek száma, melyek megkaptak egy bizonyos fragmentumot, követte a várt binomiális eloszlást, amely szerint az apai eredetű fragmentumok aránya, mely all gyermek közül pontosan r darabban található meg "Cr 2“ (lásd 4. táblázat). így feltehető volt, hogy a fenti DNS- fragmentumok követik a Mendel-féle öröklődést, és a szülői eredetű sávok értékelését, (különösen a kicsi és rosszul elválasztható fragmentumokét), nem befolyásolja szignifikánsan kettő vagy több egymásra eső fragmentum szegregációja, ami 75%-nál nagyobb átadódási gyakoriságot eredményezne. Az utódok apaságának, illetve anyaságának korrekt megállapítása szintén ezekre a DNS-ujjlenyomatokra támaszkodik. A példa szerinti sokgyermekes családban az apai és anyai eredetű DNS-ffagmentumok szegregációs mintázatainak páronkénti összevetése lehetőséget nyújt allelikus fragmentpárok és olyan további párok azonosítására, amelyek szoros kapcsoltságot mutatnak. (Egy adott sávpár véletlen koszegregációjának a valószínűsége 1/1024 ebben a családban.) Számos esetben mind az anyai, mind az apai fragmentumok alléi párjai mindkét próbával meghatározhatóak voltak. (Lásd 7. ábra.) A 33.6 próbával mind az anyában, mind az apában találtunk kapcsolt párt Hasonló kapcsolódást találtunk egy másik családfában flásd alább). Ennek alapján feltételezhetjük, hogy a 33.6 próbában legalább egy olyan hipervariábilis régió is hibridizál, amely közbülső Hinfl hasítóhely(ek)et tartalmazó miniszatellit (vagy szatellit), így a hasítás két vagy több olyan fragmentumot eredményez, amely a családban mint „haploid típusú” miniszatellit koszegregál. A 33.15 próbával meghatározott polimorf DNS-ffagmentumok egyike sem volt fellelhető a 33.6 próbával meghatározottak között. Azok a fragmentek, amelyek mindkét próbával hibridizáltak volna, egyforma helyzetű csíkként jelentkeztek volna, mint ugyanattól a szülőtől ugyanannak a gyereknek átadott fragmentek (azaz kapcsolt fragmentek). Vagyis a két próba teljesen más részét hibridizálja az emberi miniszatellit-régiónak. Az allelikus és a kapcsolt fragmentumok elhagyásával 23 különböző apai, illetve 25 különböző anyai lókuszt azonosítottunk. (Lásd 3. táblázat.) A lókuszok kb. 80%-ánál a két alléi közül csak az egyik került azonosításra, míg a megfelelő alléi párok feltehetően a rosszul elkülöníthető rövidebb miniszatellit-fragmentumok közé kerültek. Ez arra utal, hogy a miniszatellitallélok hosszában nagy különbségeknek kell lenniük, feltehetőén a tandemismétlődő régiókban lévő eltérések miatt A 7. ábrában látható azonosított alléi párok közül sok valóban lényeges hosszúságbeli különbséget mutat. Azoknak a sávoknak az arányából, melyek alléi párokhoz rendelhetők, meg lehet becsülni a 33.6 és 33.15 próbákkal detektált összes DNS-ujjlenyomatban található lókuszok számát Ez kb. 43-66 darab, amelyeknek nagyjából a fele apai, illetve anyai eredetű (lásd 3. táblázat). Az utódokba átadódott anyai, illetve apai fragmentumok között nem lehetett alléi kapcsolatot megállapítani. Az összes apai lókusz autoszomális eredetű és sem a lányok, sem a fiúk irányában nem mutattak specifikus átadódást. Továbbá az összes apai DNS-ből származó AB ffagmentumpár nyilvánvalóan független módon szegregálódott az utódokba, lényegében azonos arányban szolgáltatva AB, — és A-, -B leszármazottakat. A pontos értékek követték a várt binomiális eloszlást (lásd 4. táblázat). Az anyai DNS-ffagmentumok hasonlóképpen viselkedtek. A részletesebb vizsgálatok azt sugallták, hogy ezek között a lókuszok között a minimális távolság nagyobb mint 30 cM [46 térképegység („map units”)]. Kisebb távolság esetén szignifikánsan jelentkeznének olyan fragmentpárok, melyek koszegregációra (párba kapcsolódásra) lennének hajlamosak, vagy mint pszeudó allélek szegregálnának (vagylagos kapcsoltságban). (Lásd 4. táblázat.) A meghatározható miniszatellitek a 3000 cM hosszú emberi DNS-nek legalább a felében szétszórtan megtalálhatóak, és sok, esetleg az összes emberi autoszómán is jelen kell lenniük. Az anyai fragmentumok egyike (lásd 7. ábra) laza kapcsoltságot mutat a neurofibromatózissal, mivel all gyerek közül 10-nél megfigyelhető volt a fragmentum és a betegség közti kapcsoltság (0-10 cM, p-0,006). Mivel azonban 25 különböző anyai lókuszt azonosítottunk, igen nagy (p-0,24) a valószínűsége annak, hogy legalább az egyik ilyen fókusznak az egyik allélja véletlenszerűen mutatja a kapott mértékű páros vagy vagylagos kapcsoltságot. 9. példa Egy nagy család több generációjának DNS-ujjlenyomatai: a HPFH-val való esetleges kapcsoltság vizsgálata Egy nagy, négygenerációs ázsiai gujerati családra is alkalmaztuk a DNS-ujjjlenyomat-analízist, amelyben mind ß-thalassemia, mind az örökletesen fennmaradó magzati hemoglobint eredményező betegség (HPFH) szegregációja megfigyelhető volt A 8. A és 8. B ábrákon bemutatott jellemző szegregációs mintázatok autoradiogrammjait a következő módon kaptuk. 10 pg vérből nyert DNS-t HinfI enzimmel emésztettünk, és a 7. ábra szerinti DNS-ujjlenyomatokat állítot-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 20
