203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 A találmány tárgya eljárás olyan polinukleotidok előállítására, amelyek hibridizációs tesztanyagként (a továbbiakban próbaként) szolgálhatnak humán vagy állati genomok vizsgálatához, valamint eljárás genomi DNS azonosítására ilyen hibridizációs próbákkal. Az azonosítási módszer hasznos - például - apasági és anyasági vizsgálatoknál, a törvényszéki orvostanban, valamint a genetikai betegségek és a rák diagnosztizálásában. A genetikai változatosság kimutatására szolgáló legelterjedtebben használt módszer a restrikciós fragmentek méretbeli polimorfizmusának vizsgálatán alapul (RFLP-restriktion fragment length polymorphism). Lásd, például, a Huntington szindróma kialakulásáért felelős hibás DNS-lókusz azonosítását (J. F. Gusella és mtsai, Nature 306, 234-238, 1983), valamint a retinoblasztomára való hajlam elemzését (W. K. Cavanee és mtsai, Nature 305,779-784,1983). A legtöbb RFLP olyan kismértékű DNS-szerkezetváltozásokon - általában báziskicserélődésen - alapul, amelyek új specifikus restrikciós endonukleáz-hasítóhelyeket hoznak létre, vagy meglévő hasítóhelyeket szüntetnek meg. Mivel a humán DNS átlagos heterozigoticitása alacsony (kb. 0,001 bázispáronként), egy adott lókuszon belül ritkán lehet RFLP-t kimutatni. Ha egy RFLP-t egyáltalán sikerül kimutatni, a heterozigótaság akkor is többnyire csak dimorfizmusként jelentkezik (egy restrikciós endonukleáz-hasítóhely megléte vagy hiánya), s mivel a heterozigótaság az allélok gyakoriságától függ, ezért a heterozigótaság ilyen esetekben sohasem haladhatja meg az 50%-ot, de általában annál lényegesen alacsonyabb. Emiatt az ilyen RFLP-k kevés információt nyújtanak családfavizsgálatoknál minden olyan esetben, ha egy kritikus személy homozigóta. A genetikai analízis nagymértékben egyszerűsíthető, amennyiben olyan DNS-szakaszokhoz rendelkezünk hibridizációs próbákkal, amelyek multiallelikus variációt, és ennek következtében magas heterozigoticitást mutatnak. Ilyen régiót először A. R. Wyman és mtsai izoláltak véletlenszerűen egy emberi DNS-ből előállított génkönyvtárból (Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 6754- 6758, 1980). Ebben a lókuszban a multiallelikus varáció szerkezeti alapjai még tisztázatlanok. Ezt követőén - ismét véletlenszerűen - több más rendkívül variábilis régiót is felfedeztek a humán inzulingén közelében (G. J. Bell és mtsai, Nature 295, 31-35, 1982), a zétaglobin-gének közelében (N. J. Proudfoot és mtsai, Cell 31, 553-563, 1982 és S. E. Y. Goodboum és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80,5022-5026), valamint a c-Ha-ras-1 onkogén közelében (D. J. Capon és mtsai, Nature 302, 33-37, 1983). A variábilis régió minden esetben egy rövid szekvenciarészlet tandem ismétlődéséből áll (ún. „miniszatellit”-szekvencia), és a polimorfizmust az ismétlődések számának allelikus különbözősége okozza. Ez az allelikus különbség feltehetően a mitózis vagy meiózis során lejátszódó egyenlőtlen DNS-kicserélődés, vagy a replikáció alatti DNS-csúszás következménye. Az így kialakuló miniszatellithossz-variáció bármely olyan restrikciós endonukleáz segítségével kimutatható, amelynek az ismétlődési egységen belül nincs hasítóhelye. A feltaláló és munkatársai 1984-ben beszámoltak egy 33 bázispáros szekvenciarészlet négyszeres tandem ismétlődéséből álló miniszatellit-régió felfeldezéséről, amely a humán mioglobingén egyik intronjában található (P. Weller és mtsai, EMBO J. 3, 439-446, 1984). Kimutatták, hogy a 33 bázispáros ismétlődő egység csekély szekvencia-homológiát mutat a fent említett, mások által jellemzett többi humán miniszatellittel. A cikkben hangot adtak annak a feltételezésnek, hogy a miniszatellit-régiók transzpozíciós események során is keletkezhettek. Amennyiben a 33 bázispáros ismétlődő egység transzponábilis elem lenne, akkor ezt az egységet hibridizációs próbaként használva lehetőség nyílna új tandemismétlődéseket tartalmazó régiók felfedezésére a humán genomban, s ezek a régiók gyakran kapcsolatosak multiallelikus polimorfizmussal, az ismétlődések számának különbözősége miatt. A feltaláló és munkatársai hibridizációs vizsgálatokat végeztek humán genomi DNS-en a mioglobingénből származó 33 bázispáros szekvenciarészlet tandemismétlődéseit tartalmazó hibridizációs próba segítségével. Három személy (apa, anya, leányuk) genomi DNS- ének több különböző régiójában polimorfikus variáció meglétét mutatták ki. A varicáió a nagyobb fragmentek (2-6 kilobázis) tartományában jeletkezett. Az adatok több miniszatellit-régió hosszának változékonyságában megnyilvánuló, stabilan öröklődő polimorfizmusra utalnak. További vizsgálatok azt mutatták, hogy lehetséges olyan hibridizációs próbával vizsgálni a genomi DNS-t, amely sokkal hatékonyabban mutatja ki a miniszatellit, vagy hipervariábilis régiók változékonyságát, mint a mioglobingénből származó, 33 bázispáros ismétlődő egységet tartalmazó próba. A találmány azon a felfedezésen alapul, hogy az emberi és állati genomi DNS-ek sok miniszatellit-régiója tartalmaz egy olyan szekvenciarészletet, amely nagy homológiát mutat a többi miniszatellit megfelelő részletével. Ez a közös, ún. „core”-régió rövid, kb. 16 bázispár hosszúságú. Azt találtuk, hogy egy hibridizációs próba, melynek fő alkotórésze egy olyan szekvenciarészlet, amely legalább háromszoros tandemismétlődésként tartalmaz egy rövid „core”-szekvenciát, sok különböző miniszatellit-régiót képes azonosítani a genomi DNS-ben, olyan nagy pontossággal, ami lehetővé teszi az egyének „ujjlenyomat megbízhatóságú” genetikai azonosítását, DNS-ük megfelelő régióiban található különbözőségük alapján. Ez a kiváló eredmény rendkívül váratlan volt, mivel a korábbi kutatások csak olyan hibridizációs próbákat eredményeztek, amelyek mindössze egy-egy miniszatellit-régió kimutatását tették lehetővé. Ezek a korai hibridizációs próbák is jobb lehetőséget adtak a genetikai azonosításra, mint az RFLP-vizsgálatok, de ez az azonosítás nem volt „ujjlenyomat pontosságú", egyénenként tökéletesen jellemző és különböző. Jellemzően azt találtuk, hogy a jelenleg használt „core"-hibridizációs próba képes különb5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
