203790. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dipeptidek előállítására enzimatikus úton
1 HU 203 790 B 2 Enzim Szubsztrát Nukleofil Konc. Tennék Hozam (mól/l) (%) CPD-MII" Phe-OEt metionin 0,4 Phe-Met-OH 10 CPD-Wb) Phe-OEt arginin 0,8 Phe-Arg-OH 8 *> 20 pmóVl, 1 mmól/1 EDTA, 2 mól/l NaCl b> 10 jimól/1, 1 mmól/1 EDTA 10 15. példa DT-Dipeptidek árpából és búzából származó karboxipeptidázok katalizálta szintézise D-fenilalanin-etil-észter szubsztrátból és szabad L-aminosav nukleofilkomponensekbó'l, vízben pH 8,0 értéken Szubsztrát kiindulási koncentrációja: 50 mmól/1 Enzim Szubsztrát Nukleofil Konc. (mól/l) Tennék Hozam (%) CPD-MII1» phe-OEt metionin 0,4 phe-Met-OH 15 CPD-W» phe-OEt arginin 0,8 phe-Arg-OH 13 CPD-W» phe-OEt metionin 0,4 phe-Met-OH 40 *> 20 pmól/1,1 mmól/1 EDTA, 2 mól/l NaCl b> 10 pmól/1,1 mmól/1 EDTA, 2 mól/l NaCl, reakcióidó>20 óra, konverzió<50% 16. példa LJL-Tirozil-cisztein (Tyr-Cys-OH) preparatív szintézise 1,5 g (6 mmól) L-tirozin-etil-észter-hidrogén-kloridot és 15,2 g (125 mmól) L-ciszteint 110 ml 0,1 mól/1- es, 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó kálium-klorid-oldatban oldunk. Az oldat pH-ját trietil-aminnal 8,0-ra állítjuk. A reakciót 7,5 ml, 16 mg/ml koncentrációjú karboxipeptidáz-Y-oldat hozzáadásával indítjuk, és a pH-t trietil-amin hozzáadásával 8,0 értéken tartjuk a reakció folyamán. A reakciót állandó keverés mellett, szobahőmérsékleten játszatjuk le. A szubsztrát fennmaradó részét (13,5 g, 54 mmól) 14 g-os részletekben adjuk az oldathoz, 1 óra alatt. Fél óra múlva megindul a tirozin kicsapódása, és 3,5 óra múlva a reakciót az elegy 45 "C-on 20 percen keresztüli melegítésével leállítjuk. A képződött tirozint leszűrjük, és a szűrletet R-preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (Waters Prep. L C/500 A rendszer) tisztítjuk, két 5,7*30 cm-es, 60 Jim-es Cu-részecskékkel töltött oszlopot, és 50 mmól/1 koncentrációjú ecetsavoldatot, mint eluenst használva. A kívánt terméket tartalmazó összegyűjtött frakciókat vákuumban szárazra pároljuk, miközben többször vízmentes etanolt adunk hozzá. A maradékot dietil-éterrel eldőrzsöljük, majd szűrjük és szárítjuk. 3,88 g (14 mmól, 22%) L,L-tirozil-ciszteint kapunk. Azonosítás Kloridot és acetátot nem mutattunk ki, a termék ikerion formában van jelen. A savas hidrolízist és a Cys akrilonitriles derivatizálását követő aminosav-analízis eredménye a következő: Tyr (1,00), Cys (1,08). Tisztaság A cisztein-oldallánc akrilonitriles derivatizálását kö- 30 vetően vékonyréteg-kromatográfiás eljárással Kieselgel 60-F lemezen, ninhidrines előhívással csak egyetlen foltot kapunk, amelynek Rf értéke 0,73 (eluens: etil-acetát, butanol, ecetsav és víz 1:1:1:1 térfogatarányú elegye). 35 HPLC-tisztaság: 99,5% (nukleosile 7 Cu, 0,1 mól/l ammónium-foszfát, pH 3,0/acetonitril, 220 nm). UV-meghatározás: 98,5% (293 nm, tirozin abszorpció 0,1 mól/l-es NaOH-oldatban), 40 17. példa LXrMetionil-metionin (Met-Met-OH) preparatív szintézise 24.6 g (115 mmól) L-metionin-etil-észter-hidrogénkloridot és 20,6 g (138 mmól) L-metionint 190 ml, 45 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó 0,1 mól/l koncentrációjú kálium-klorid-oldatban oldunk, és a pH-t nátrium-hidroxid-oldattal 9,0-re állítjuk. A reakciót 14,2 ml, 20 mg/ml koncentrációjú karboxipepddáz-Y-oldat hozzáadásával indítjuk el, és a reakcióelegyet egy éjszakán keresztül 50 szobahőmérsékleten keverjük, miközben a pH-t nátriumhidroxid-oldat pH-sztátból való beadagolásával 9,0 értéken tartjuk. A reakció befejezésekor a pH-t hidrogén-klorid-oldattal 3,0-ra állítjuk. A kicsapódott metionint leszűrjük, és a szűrletet 55 R-preparatív HPLC eljárással tisztítjuk, a 16. példában leírtak szerint. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepárlással koncentráljuk, majd fagyasztva szárítjuk. 10.6 g (37,8 mmól, 33%) L-metionil-L-metionint 60 kapunk, amorf, fehér por formájában. 10
