203790. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dipeptidek előállítására enzimatikus úton
1 HU 203 790 B 2 Azonosítás Kloridot nem mutattunk ki, és csak 1,9 tömeg% acetát mutatható ki, a termék túlnyomórészt ikerionformában van jelen. A szabad metionintól mentes nem-hidrolizált mintákban a savas hidrolízist követően aminosav-analízissel metionin mutatható ki. Tisztaság HPLC meghatározás szerint: 99,8% (nukleosile 7 Cu, 0,1 mól/1 ammónium-foszfát, pH 3,0/acetonitril, 220 nm). Trinitro-benzolszulfonsawal reagáltatva, majd UV- méréssel: 92,5%. Víztartalom Karl Fisher szerint: 1,5%. 18. példa LE-Tirozil-valinamid (Tyr-Val-Nfy) preparatív szintézise 16,0 g (65 mmól) L-tirozin-etil-észter-hidrogén-kloridot és 60 g (390 mmól) valinamid-hidrogén-kloridot 1150 ml vízben oldunk, és hozzáadunk 65 ml 20 mmól/1 koncentrációjú EDTA-oldatot. A pH-t nátrium-hidroxidoldattal 9,0-re állítjuk, és a reakciót 12 ml, 20 mg/ml koncentrációjú karboxipeptidáz-Y-oldat hozzáadásával indítjuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 órán keresztül keverjük, és a pH-t nátrium-hidroxid-oldattal 9,0 értéken tartjuk. A teljes konverzió után a reakciót a pH 11-re való emelésével leállítjuk. A denaturált enzimet leszűrjük, és a reakcióelegyet hígítjuk, és egymás után Dowex A61*4 anioncserélő oszlopon, és Dowex A650W*4 kationcserélő oszlopon tisztítjuk, nátrium-, illetve ammónium-acetát-só-gradiensekkel eluálunk, és a terméket sótalanítjuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és vákuumban, vízmentes etanol ismételt hozzáadásával szárazra pároljuk. 11,2 g (40 mmól, 62%) L,L-tirozil-valinamidot kapunk, fehér por formájában. Azonosítás 1,8 tömeg% acetátot mutattunk ki, a termék túlnyomórészt ikerion formájában van. Savas hidrolízist követően aminosav-analízissel a következő eredményt kapjuk: Tyr (1,01), Val (0,99). Tisztaság HPLC-tisztaság: 99,5% (Novapak Ci», 0,1 mól/1, alkilszulfonátot tartalmazó ammónium-foszfát, pH 4,5/acetonitril, 220 nm). UV-meghatározás: 97,8% (293 nm, tirozin-abszorpció 0,1 mól/l-es NaOH-oldatban). 19. példa DJL-Tirozil-arginin (DX-’tyr-Arg-OH) preparatív szintézise 105 g (603 mmól) L-arginint 400 ml vízben oldunk, és a pH-t hidrogén-klorid-oldattal 9,0-re állítjuk. Hozzáadunk 6,1 g (25 mmól) D-tirozin-etil-észter-hidrogén-kloridot és 5 ml 0,1 mól/1 koncentrációjú EDTA- oldatot, majd apH-tújra 9,0-re állítjuk. A reakciót 7 ml, 20 mg/ml koncentrációjú karboxipeptidáz-Y-oldat hozzáadásával indítjuk, és a pH-t nátrium-hidroxidoldat beadagolásával 9,0 értéken tartjuk. 4 óra múlva a reakciót a pH 3,0-ra állításával (hidrogén-klorid-oldattal) leállítjuk. A reakcióelegyet hígítjuk és Dowex A650*4 kationcserélő oszlopon tisztítjuk, ammónium-acetát-só-gradiens elucióval, végül sómentesítjük. A terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, majd fagyasztva szárítjuk. 6,45 g (19 mmól, 77%) DJL-tirozil-arginint kapunk, fehér por formájában. Azonosítás Acetátot és kloridot nem mutattunk ki, a termék ikerion-formában van. Savas hidrolízis után a következő aminosav-analízis eredményt kapjuk: Arg (1,03), Tyr (0,97). Tisztaság HPLC-tisztaság: 99,5% (Novapak Cu, 0,1 mól/1 koncentrációjú, alkil-szulfonsavat tartalmazó ammónium-foszfát- oldat, pH 4,5/acetonitril, 220 nm). Víztartalom Karl Fischer szerint: 3,4%. 20. példa DJL-Fenilalanil-metionin (DJL-phe-Met-OH) preparatív szintézise immobilizált karboxipeptidáz Y enzimmel Enzim immobilizálása A karboxipeptidáz Y enzimet Eupergit C-n immobilizáljuk, a gyártó cég előírásainak betartásával. Az immobilizálást foszfátpufferben (pH 7,5) hajtjuk végre, és a maradék aktív gélcsoportokat etanol-aminnal blokkoljuk, pH 8,0 értéken, majd mossuk. A 2,5 mg protein/ml enzimtartalmú gélhez az enzim 93%-a kötődik. Az Eurpergit C-hez kötött enzimet 10 mmól/1 PIPES, 1 mmól/1 EDTA, 0,05% hidroxi-benzoesav-etil-észter (pH—7,0) elegyében tároljuk, 4 'C-on. Peptid előállítása 5,7 g (25 mmól) D-fenilalanin-etil-észter-hidrogénklorid és 29,8 g (200 mmól) L-metionin 400 ml vízzel készült oldatához 5 ml 0,1 n FDTA-oldatot adunk, és a pH-t nátrium-hidroxid-oldattal 9,0-re állítjuk. A reakcióelegy térfogata így 500 ml. A reakcióelegyet folyamatosan keverjük, és a pH-t nátrium-hidroxid-oldattal 9,0 értéken tartjuk, miközben az oldatot immobilizált CPD-Y-nal töltött oszlopon keresztül cirkuláltatjuk, 3 ml/perc átfolyási sebességgel. Az oszlop a fentiek szerint előállított, Eupergit C-n immobilizált CPD-Y-t tartalmaz, mérete 2,5 cm*5,5 cm, térfogata 27 ml, és összesen 67 mg CPDY-t tartalmaz. A ciriculáltatást 10 órán keresztül folytatjuk. A pH-t ezután hidrogén-klorid-oldattal 7-re állítjuk, és a terméket R-preparatív HPLC eljárással tisztítjuk, a 16. példában leírtak szerint. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
