203790. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dipeptidek előállítására enzimatikus úton
1 HU 203 790 B 2 Ezt a meglepő hidrolízislefolyást tükrözik az alábbi példák is, amelyekben bemutatjuk a különféle dipeptidek előállítását a találmány szerinti eljárással, CPD-Y és maláta karboxipeptidáz II (CPD-MII), vagy búza karboxipeptidáz (CPA-W) alkalmazásával. A találmány szerinti eljárást - amelyet az 1-15. példákban szemléltetünk - általában az alábbi módon hajtjuk végre. A reakciókat - amelyeket analitikai mennyiségben, 1 ml-es térfogatban játszatunk le - pH-sztátban végezzük, és a választott pH-értéket 1 n nátrium-hidroxid-oldat automatikus beadagolásával tartjuk állandó értéken. A reakciót szobahőmérsékleten játszatjuk le, hacsak azt másként nem említjük. A táblázatokban megadjuk a reaktáns-koncentrációkat, a szerves oldószer mennyiségét, a terméket és a hozamot is. A reakcióidő általában 0,5 és 5 óra között változik, és az enzim-koncentráció általában 10-20 (rmól, ha ettől eltérő módon nem jelezzük. A termék azonosítását és a hozamok megállapítását fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással végezzük (Waters 6000 A szivattyú, 660 grádiens-keverő, UK 6 injektor), Cu NOVA PÁK oszlopon (Waters, RCM), megfelelő grádiensű eluálórendszereket alkalmazva, amelyek 50 mmól/1 trietil- ammónium-foszfátot (pH 3,0) és 0-80% acetonitrilt tartalmaznak, az átfolyási sebesség 2 ml/perc. Az eluálást UV-detektoiral (Waters 480) követjük, 230, 254, 278 vagy 290 nm hullámhosszon. A termékeket aminosav-analízissel azonosítjuk a nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással kapott frakciókból, amelyek a feltételezett termék csúcsának felelnek meg, és/vagy egy kémiailag szintetizált referenciavegyülettel való nagynyomású folyadékkromatográfiás összehasonlítással. A referenciavegyületeket szokásos eljárással állítjuk elő, BOC-A-OSu - szubsztrátkomponens terc-butoxi-karbonil-szukcinimidészter származéka - és a kérdéses nukleofilkomponens reagáltatásával, majd az aminosavmaradék N-terminális védőcsoportjának eltávolításával. Minden esetben el tudtuk választani az L,L- és D,D-dipeptideket a diasztereomer D,L- és L,D-dipeptid termékektől. Azoknál a termékeknél, amelyeket csak 230 nm-nél tudtunk detektálni, a termékhozamot a kémialilag szintetizált referenciavegyület abszorpció/koncentráció görbéjének segítségével határoztuk meg. A többi terméknél a hozamokat az adott hullámhosszon abszorbeáló termék, illetve reaktáns eluciós görbéjében a csúcs alatti területek arányának alapján határoztuk meg. A 16-21. példákban a reakciókörülményeket példánként ismertetjük. A reakció lejátszatása után analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiát alkalmaztunk, a fent ismertetett módon. Az enzim-koncentráció általában alacsonyabb, és a reakcióidő általában hosszabb volt, mint a megfelelő analitikai példákban, de nem kíséreltük meg a reakciókörülmények optimalizálását. 1. példa L£,-Dipeptidek karboxipeptidáz Y katalizálta szintézise L-tirozin-etil-észterből, mint szubsztrátkomponensből, és nukleofilkomponensként szabad aminosavakból Enzim: 10 jimól/1, EDTA: 1 mmól/1, Szubsztrátkomponens: 50 mmól/1 5 10 15 20 25 30 Nukleofil Koncentráció (mól/1) Oldószer pH Termék Hozam (%) alanin 1,9 víz 9,5 Tyr-Ala-OH 10 arginin 0,8 víz 9,5 Tyr-Arg-OH 31 cisztein 1 víz 8,0 Tyr-Cys-OH 30 L,D-cisztein 2 víz 8,0 Tyr-Cys-OH (L,L) 40 leucin 0,2 víz 8,0 Tyr-Leu-OH 1 lizin 2 víz 9,5 Tyr-Lys-OH 18 metionin 0,3 víz 8,0 Tyr-Met-OH 8 metionin 0,3 víz 9,0 Tyr-Met-OH 9 metionin 0,3 30% DMSO 9,0 Tyr-Met-OH 15 metionin 0,3 15% EtOH 9,0 Tyr-Met-OH 7 glutamin 0,8 víz 9,5 Tyr-Gln-OH 8 penicillamin 0,5 víz 8,0 Tyr-Pen-OH 7 2. példa LL-Dipeptidek karboxipeptidáz Y katalizálta szintézise L-metionon nukleofilkomponenssel, 55 vízben, pH 9,0 értéken Enzim: 10 Hmól/1, EDTA: 1 mmól/1, L-metionin: 0,3 mól/1 60 Szubsztrát (50 mmól/1) Termék Hozam (%) leucin-metil-észter Leu-Met-OH 30 leucin-izopropil-észter Leu-Met-OH 36 metionin-etil-észter41 Met-Met-OH 25 fenilalanin-metil-észter Phe-Met-OH 16 fenilalanin-etil-észter Phe-Met-OH 19 6
