203790. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dipeptidek előállítására enzimatikus úton
1 HU 203 790 B 2 tideket is előállíthatunk, amelyeket azután lehasítunk, a szabad karboxilcsoport kialakítására. A fenti hasítást ugyanaz, vagy hasonló enzim katalizálhatja, mint amelyet a peptid előállítására használunk. Enzimeket használhatunk az oldallánc-védőcsoportok lehasítására is, erre a célra proteolitikus enzimeket, lipázokat és észterázokat hsználhatunk, a védőcsoport természetétől függően (lásd „The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology” 9. kötet, Special Methods in Peptide Synthesis, C rész, J. A. Glaas, Enzymatic Manipulation of Protecting Groups in Peptide Synthesis, Academic Press 1987). A találmány szerinti eljárást CPD-Y enzimmel hajthatjuk végre, ez jelenleg a legelőnyösebb enzim, amelyet közelebbről a 17 485 számú európai szabadalmi leírásban ismertetnek; valamint egyéb szerin- vagy tiol-karboxipeptidáz enzimekkel, amelyeket aíább felsorolunk, mivel ezek közös mechanizmus szerint fejtik ki aktivitásukat, acil-enzim köztitermékeken keresztül. Enzim Eredet Gomba Penicillo-karboxi-peptidáz S-l Pénicillium janthinellum S-2 Karboxipeptidáz(ok) Aspergillus saitoi Aspergillus oryzae Növény Karboxipeptidáz(ok) C naracslevél narancshéj Karboxipeptidáz C„ Hayata Citrus natsudaidai Fazeolin bablevél Karboxipeptidáz(ok) csíráztatott árpa vagy maláta csíráztatott gyapotnövény paradicsom görögdinnye Bromolein (ananász) por A fent említett karboxipeptidázok számos tagja közötti szoros rokonságot Kubota és munkatársai [Carboxypeptidase C, J. Biochem. 74, 757-770 (1973)] ismertették. A malátából, búzából és egyéb forrásokból származó karboxipeptidázokat Breddam [Carlsberg Res. Comm. 51,83-128 (1986)] írta le. A karboxipeptidázokat kémiailag is módosíthatjuk, vagy egy természetes forma bioszintetikus mutánsai is lehetnek. Amint azt alább részletesen ismertetjük, a találmány szerinti eljárás meglehetősen egyszerű; azonban fontos, egy viszonylag állandó pH-értéket tartani a reakcióelegyben. Ez a pH-érték 5 és 10,5 között lehet, előnyösen 7 és 9,5 közötti, de az adott kiindulási anyagoktól is függ, valamint a keletkező peptidtől és az enzimtől. A reakciót vizes reakcióközegben játszatjuk le, amely kívánt esetben legfeljebb 70% mennyiségben szerves oldószert is tartalmaz. A szerves oldószer vízzel elegyedő vagy nem elegyedő oldószer lehet, amely az enzimmel az adott reakciókörülmények között összeférhető. Oldószerként előnyösen rövidszénláncú alkoholokat, dimetil-formamidot, dimetil-szulfoxidot, dimetoxi-etánt, etilénglikolt és etil-acetátot használhatunk. A reakcióhőmérséklet előnyöen szobahőmérséklet, vagy afölötti, 20 és 50 *C között változhat, de dolgozhatunk 0 és 60 *C közötti hőmérsékleten is, ha ez az egyébként alkalmazott reakciókörülmények között előnyös. A reaktánsok koncentrációja tág határok között változhat, de a nukleofilkomponenst rendszerint feleslegben alkalmazzuk a szubsztrátkomponens oligomerizációjának elkerülésére, a fenti komponenst gyakran kis részletekben adagoljuk, és a beadagolás a teljes reakció alatt folytatódik. Ha az alkalmazott észter etilészter, vagy ennél nagyobb szénatomszámú, meglepő módon nem tapasztalunk oligomerizációt, és igen nagy szubsztrát-koncentrációkat alkalmazhatunk anélkül, hogy mellékreakciók játszódnának le. Ebben az esetben egy homo-dipeptid (amelyben A-B) is előállítható oligomerizáció nélkül, egyetlen kiindulási vegyületből, a nukleofilt in situ állítjuk elő, az észter hidrolízisével. Bizonyos esetekben ez egy további előnyt jelent (lásd 2. ábra). A szubsztrátkomponens kiindulási koncentrációja a fentieknek megfelelően általában 0,005-2 mól lehet, és a nukleofil-komponensé abban az esetben, ha külön adagoljuk, 0,005-3 mól. A legtöbb esetben a nukleofilkomponens feleslegét visszanyerhetjük, és a szubsztrátkomponens hidrolízistermékét adott esetben újraészterezhetjük, és így újra felhasználhatjuk a reakcióban. A komponensek visszavezetése a reakcióba különösen egyszerű, mivel szerkezetük egyszerű, és nincsenek mellékreakciók, és védőcsoport-eltávolításból eredő veszteségek. Az enzim-koncentráció szintén változhat, azonban gyakran valamivel magasabb (5-50 pmól), mint az N-védett aminosav-észter szubsztrátok esetén alkalmazott koncentráció. Azonban - amint ezt az alábbi példák bizonyítják - a szintézishez szükséges mennyiséget több, mint tizedrészére csökkenthetjük, ha stabil, immobilizált enzimkészítményt használunk, amivel lehetővé válik az enzimnek folyamatos eljárásban való alkalmazása. A reakcióközeg sót - például nátrium-kloridot - is tartalmazhat, ami a szubsztrát enzimhez való kötődését befolyásolja; valamint a jelen lévő fémionokat komplex formában megkötő szert - például EDTA-t -, ami az enzimet stabilizálja. A D- és L-szubsztrátok esetén meglévő reakciósebesség-különbséget - amint már fent említettünk - az 1. ábrával szemléltetjük, ami egy védett vagy védetlen D- vagy L-formában lévő aminosav-észter (Tyr-OEt) CPD-Y enzimmel való hidrolízisének reakciólefolyását mutatja. A fenti ábrából látható, hogy míg az L-Ac-Tyr-OEt majnem azonnal hidrolizálódik, a D-Ac-Tyr-OEt csak elhanyagolható mértékben (5% alatt) hidrolizálódik két Óra alatt Ezzel szemben, a védetlen L- és D-formában lévő észterek hidrolízisében csak kis különbségek tapasztalhatók. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
