203790. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dipeptidek előállítására enzimatikus úton
1 HU 203 790 B 2 Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a 17 485 számú európai szabadalmi leírás szerinti eljárásban használt szerin- és tiol-karboxipeptidázok képesek szubsztrátkomponensként használni az N-terminálison védőcsoportot nem tartalmazó aminosav-észtereket di- 5 peptidek és dipeptidszármazékok előállítására szolgáló szabályozott reakciókban, és a szubsztrát oligomerizációjának megakadályozása is lehetséges. Ezenkívül meglepő módon azt is tapasztaltuk, hogy a D-konfigurációjú, N-terminálison védőcsoportot nem 10 tartalmazó aminosavszármazékok is alkalmazhatók szubsztrátként ezekben a reakciókban, és így, az L,L-dipeptidek mellett D,L-dipeptideket is tudunk előállítani. A D-szubsztrátok esetén azonban a reakciósebesség valamivel kisebb, mint az L-szubsztrátoknál, azonos körül- 15 mények között, a reakciósebességek közötti különbség azonban - amint azt alább bizonyítjuk - sokkal kisebb, mint a megfelelő N-védett aminosav-észterek esetén, ahol a D-szubsztrát reakciósebessége sokkal kisebb, mint az L-szubsztráté. A hozamok gyakran ugyanolyan na- 20 gyök, vagy nagyobbak a védőcsoport nélküli D-szubsztrátokkal, mint a védőcsoport nélküli L-szubsztrátokkal, amint azt az alábbi példák mutatják. Továbbá méginkább meglepő az a tapasztalatunk, hogy a fenti szeikezető szubsztrátokkal a D-konfigurá- 25 ciójú nukleofilek sokkal könnyebben kapcsolhatók a fenti enzimek segítségével, amelyek egyébként L-specifíkusként ismertek a szintézis amin- komponensének tekintetében. A fenti módon beépített aminosav-észter nem hidro- 30 lizál a későbbiekben. A találmány szerint úgy járunk el, hogy egy (II) vagy (ül) általános képletií szubsztrátkomponenst a képletekben A jelentése a tárgyi körben megadott, 35 R1 jelentése hidrogénatom, egyenes vagy elágazó szénláncú, adott esetben hidroxilcsoporttal szubsztituált 1-4 szénatomos alkil- vagy benzilcsoport -, egy nukleofilkomponenssel reagáltatunk, amelyet abban az esetben, ha A-B, in situ is előállíthatunk, és 40 amely (a) egy (IV) általános képletű aminosav - a képletben B jelentése egy, a tárgyi körben megadott amino-karbonsav -, vagy 45 (b) egy (V) általános képletű aminosavamid - a képletben B jelentése egy, a tárgyi körben megadott amino-karbonsav -, vagy 50 (c) egy (VI) általános képletű aminoav-észter- a képletben B jelentése egy, a tárgyi körben megadott amino-karbonsav, és R4 jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport -, vagy 55 egy (VII) vagy (Vm) általános képletű, egyenes vagy elágazó szénláncú amino-foszfonsav vagy amino-szulfonsav - a képletekben x értéke 1-2, és z értéke 2-4 - 60 lehet, élesztőből származó, vagy állati, növényi, vagy egyéb, mikrobiológiai eredetű adott esetben immobilizált szerin-, vagy tiol-karboxi-peptidáz jelenlétében, pH 5 és 10,5 közötti, adott esetben szerves oldószert és/vagy sót tartalmazó vizes oldatban vagy szuszpenzióban, majd kívánt esetben lehasítjuk az adott esetben jelen lévő oldallánc-védőcsoportot vagy Y védőcsoportot és/vagy kívánt esetben a kapott dipeptid-származékot sóvá alakítjuk. A találmány szerinti eljárásban használható aminosavak alifás aminosavak, például monoamino-monokarbonsavak, így glicin (Gly), alanin (Alá), valin (Val), norvalin (Nval), leucin (Leu), izoleucin (Izo-Leu), és norleucin (Nleu); hidroxi-aminosavak, így szerin (Ser), treonin (Thr) és homoszerin (homo-Ser); kéntartalmú aminosavak, így metionin (Met), vagy cisztin (CysS) és cisztein (CysH); monoamino-dikarbonsavak, így aszparaginsav (Asp), glutaminsav (Glu) és amidjaik, így aszparagin (Asn) és glutamin (Gin); diamino-monokarbonsavak így omitin (Om), és lizin (Lys), arginin (Arg); aromás aminosavak, így fenilalanin (Phe) és tirozin (Tyr); valamint heterociklusos aminosavak, így hisztidin (His), prolin (Pro) és triptofán (Trp) lehetnek. Aminosavként használható továbbá például a sokkal szokatlanabb szerkezetű penicillamin (Pen), aminofoszfonsavak, így alanin-foszfonsav (AlaP); aminoszulfonsavak, így taurin (Tau); vagy omega-aminosavak, így ß-alanin (Bala) is. Mint említettük, a fenti aminosavak a szubsztrátkomponensben D-formában is lehetnek, és a nukleofilkomponensben is lehetnek D-formában is. A találmány szerinti eljárás előnyei a fent említett ismert eljárásokhoz viszonyítva az, hogy csak minimális oldalláncvédés szükséges, vagy egyáltalán nem kell oldalláncvédést alkalmazni; a D- vagy L-konfigurációban egyaránt alkalmazható szubsztrát-komponensben nem kell N-védést alkalmazni; nincs racemizáció; a szintézis-lépések szánta kevés, és a kívánt termék 80- 99,8%-os tisztaságú; és ezeknek az előnyöknek eredményeként a találmány szerinti eljárás rendkívül egyszerű és gazdaságos. Szubsztrátkomponensként előnyösek azok az észterek, amelyek képletében R* jelentése egyenes vagy elágazó szénláncú 1-6 szénatomos alkilcsoport, például metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, tercbutil-, amil- vagy hexilcsoport; vagy aralkilcsoport, így benzilcsoport Különösen előnyös nukleofilkomponensek a szabad L-aminosavak vagy aminosavamidok, amelyek képletében RJ jelentése hidrogénatom, és R3 jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport; vagy az aminosav-észterek, amelyek képletében R4 jelentése egyenes vagy elágazó szénláncú 1-6 szénatomos alkilcsoport, például a fent említett csoportok egyike. Amint azt már említettük, R1 jelentése alkil-, aril-, vagy aralkilcsoport lehet, melyek adott esetben inert szubsztituensekkel, például hidroxil- vagy nitrocsoporttal lehetnek szubsztituálva. A találmány szerinti eljárással átmenetileg -NR^3 vagy -OR4 általános képletű csoportot tartalmazó pep-4
