203787. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
1 HU 203 787 B 2 Ritkaföldfém Hozzáadott (%) Keletkezett 2-keto-L-gulonsav La2 (C204)3*9H20 0,002 73,1 (71,4%) La203 0,05 74,5 (72,8%) CeCl3*7H20 0,002 73,1 (71,4%) Ce2(C03)3*8H20 0,002 73,8 (72,1%) Ce2(S04)3»nH20 0,002 73,2(71,5%) Ce(S04)2*nH20 0,002 75,1 (73,4%) Ce02 0,05 64,5 (63,0%) Ugyanitt megadjuk a ritkaföldfém-adalék nélkül végzett tenyésztéssel kapott 2-keto-L-gulonsav mennyiségét is. A zárójelben feltüntetett adatok kitermelést jelentenek. 5. példa Bacillus megaterium (IFO 12 108) mikrobasejteket, amelyeket az 1. táblázatban megadott ferde táptalajban szaporítottunk 28 ‘C-on 2 napig, 10 ml sterilizált vízben szuszpendálunk, és az egészet egy Sakaguchi-lombikba tesszük, amely az 1. példában ismertetett 500 ml tenyésztdközeget tartalmaz és ide-oda rázással (85 rázás/perc) 28 *C-on 2 napig tenyésztjük, így a Bacillus megaterium oltótenyészetót kapjuk. 30 liter táptalajt, amelynek pH-ja-7,0 és összetétele: 4,0% szacharóz, 4,0% Őrölt gyapotmag, 0,65% K2HPO4, 0,55% KHjPO«, 0,05% ammőnium-szulfát, 0,05% NaCl, 0,05% MgS(V7H20 és 0,05% pantoténsav-kalcium-só egy 50 literes fermentorba helyezünk és 125 ”C-on 20 percig autoklávban kezeljük. A fermentort egy liter Bacillus megaterium oltótenyészettel beoltjuk és 4 napig tenyésztjük a következő feltételekkel: Keverés: 200 fordulat/perc Levegőzés: 24 liter/perc Belső nyomás: l,0kg/cm2 Hőmérséklet 28 ‘C. A kapott tenyészetet 120 ‘C-on 20 percig autoklávban kezeljük, hideg helyen tároljuk és ezt a Bacillus megaterium sterilizált tenyészetet (a továbbiakban ezt megatáptalajnak nevezzük) a fermentációs közeg egyik komponenseként használjuk. 20 ml-t az 1. példában leírt oltótenyészetből egy 200 ml-es Erlenmeyer-lombikba helyezünk és 120 ‘C-on 20 percig autoklávban kezeljük. Az 1. táblázatban ismertetett ferde közegen 28 ‘C-on 4 napig szaporított Pseudogluconobactór saccharoketogenes TH14-86 törzsből egy kacsnyi mikrobasejtet a fenti lombikba oltunk és rázással 30 ‘C-on 2 napig tenyésztjük. A kapott tenyészetből 20 ml-t egy egyliteres Erlenmeyerlombikba helyezünk, amely 200 ml táptalajt tartalmaz. Összetétele: 2,0% D-glukóz, 3,0 térfogat% megatáptalaj, 1,0% CSL, 05% élesztőkivonat, 0,1% pepton, 0,3% ammónium-szulfát, 2,0% CaCCb (Akadama) és azt rázással 30 *C-on 2 napig tenyésztjük és így a TH14-86 törzsből egy második oltótenyészetet nyerünk. Ettől függetlenül egy 200 ml-es Erlenmeyer-lombikot, amely 20 ml 2. példában leírt oltótenyészetet tartalmaz, beoltunk egy huroknyi ferde közegen 28 ‘C-on 2 napig szaporított Bacillus megaterium IFO 12 108 mikrobasejttel és rázással tenyésztjük 28 *C-on 2 napig. így egy oltótenyészetet kapunk a bekeverendő mikroorganizmusból. 72 g L-szorbózt annyi vízben oldunk, hogy az oldat térfogata 300 ml legyen. Ezután 60 g CSL-t, 6 g szárított élesztőt, 9 g ammónium-szulfátot, 3 g Fe- S04«7H20-t, 3 mg FMN-t, 3 mg tiamint, 1,5 mg biotint, és 0,5 g Actocolt (a Takeda Chemical Industries Ltd. Japán terméke) annyi vízben oldunk vagy szuszpendálunk, hogy az oldat térfogata 800 ml legyen. Külön szuszpendálunk 240 g CaC03-t (Akadama) és 150 mg Ce2(C03)3*8H20-t annyi vízben, hogy a szuszpenzió térfogata 1000 ml legyen. Miután valamennyi táptalajt 120 *C-on 20 percig autoklávban kezelünk, ezeket egy 5 literes fermentorba helyezzük, amelyet előzetesen sterilizálunk. 300 ml fentiekben leírt TH14-86 törzs második oltótenyészetet és 4 ml bekeverendő mikroorganizmus oltótenyészetet ebbe a fermentorba oltunk és a tenyésztést a következő körülmények között végezzük: Hőmérséklet: 30 ‘C Levegőztetés: 2,4 liter/perc Keverés: 800 fordulat/perc Külön feloldunk 528 g L-szorbózt és 150 mg LaCl3»7H20-t annyi vízben, hogy az oldat térfogata 900 ml legyen. 6 g ammónium-szulfátot és 3 g Fe- SC>4*7H20-t annyi vízben oldunk, hogy az oldat térfogata 100 ml legyen. Mindkét oldatot 120 ‘C-on 20 percig autoklávban kezeljük és aszeptikusán összekeverjük. A tenyészet elkezdésétől számított hatodik órától kezdve ezt a keveréket folyamatosan a fermentorba adagoljuk és az adagolást 24 óra alatt fejezzük be. Az adagolás befejezése után a tenyésztést további 8 órán keresztül folytatjuk (a teljes tenyésztési időszak 38 óra), ezalatt az L-szorbóz teljesen felhasználódik a tenyészetben és 3,16 liter fermentációs oldatot kapunk. A fermentációs oldat 176,0 mg/ml 2-keto-L-gulonsavat tartalmaz (kitermelés: 86,0%). A tenyésztést elvégezzük ugyanilyen körülmények mellett, azzal a különbséggel, hogy nem alkalmazunk Ce2(C03)3*8H20-t és LaCl3»7H20-t. Ebben az esetben a tenyésztést további 22 órán keresztül folytatjuk a keverék hozzáadása után és így az L-szorbóz teljesen elfogy. (Teljes tenyésztési periódus: 52 óra) Az így nyert fermentációs oldatban (3,09 liter) 161,4 mg/ml 2-keto-L-gulonsav mutatható ki. (Kitermelés: 77,1%) 6. példa 260 ml 6 n kénsavat keverés közben hozzáadunk 1 liter 5. példában előállított fermentációs oldathoz, amely 176,0 mg/ml 2-keto-L-gulonsavat tartalmaz. A keletkezett oldhatatlan részeket, például gipszet és sejteket cetrifugálással elválasztjuk. A kapott felülúszót (1,150 ml) IR 120B típusú (H+ típusú, a Rohm and Haas, USA terméke) kationcserélő gyantát tartalmazó oszlopon keresztülbocsátjuk (200 ml), majd az oszlopot 150 ml desztillált vízzel mossuk. Az eluátumot és a mosóoldatokat egyesítjük és egy olyan oszlopra visszük, amely 200 ml Shirasagi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
