203787. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
1 HU 203 787 B 2 Xanthomonas citri IFO 3835, Flavobacterium meningosepticum IFO 12 535, Micrococcus variáns IFO 3765, Escherichia coli IFO 3366. Ha bármelyik felsorolt baktériumot megfelelő tápközegben 20-40 *C közötti hőmérsékleten 1-4 nap időtartamig tenyésztünk, a folyékony tenyészet oltókultúraként alkalmazható a keverendő mikroorganizmushoz. Általában oltóanyagként a Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó oxidációs baktériumnak előnyösen 1/10-1/1000 részét alkalmazzuk. Ha tehát vegyes kultúrát készítünk a felsorolt keverőmikroorganizmusból és az oxidációs baktériumból a megjelölt arányban, ezzel elősegítjük az oxidációs baktérium növekedését és ezáltal az L-szorbóz 2-keto-L- gulonsavvá történő oxidációja gyorsabban és nagyobb kitermeléssel megy végbe, mint amikor az oxidációs baktériumot egyedül alkalmazzuk. Lényeges, hogy a bekeverendő mikroorganizmus ne, vagy csak kismértékben asszimilálja az L-szorbózt, amely a jelen találmány kiindulási anyaga, vagy a 2-keto-L-gulonsavat, amely a találmány célvegyülete. A tenyésztés egyéb körülményei megegyeznek azzal, amikor az oxidációs baktériumot egyedül alkalmazzuk. A fent említett oxidációs baktériumokon kívül bizonyos más baktériumfajták sterilizált tenyészetét is hatékonyan alkalmazhatjuk mint a tápközeg egyik alkotórészét. Ilyen baktériumokra példaként megemlítjük a Bacillus, Pseudomonas, Citrobacter, Escherichia és Erwinia nemzetséghez tartozó baktéiriumokaL Pontosabban a következő baktériumokat nevezzük meg: Bacillus cereus IFO 3131, Bacillus subtilis IFO 3023, Bacillus pumilus IFO 12 089, Bacillus megaterium IFO 12 108, Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022, Pseudomonas trifolii IFO 12 056, Citrobacter freundii IFO 12 681, Escherichia coli IFO 3546, Erwinia herbicola IFO 12 686. Ezeket a baktériumokat 20-40 *C közötti hőmérsékleten 2-4 nap közötti időtartamig tenyésztjük egy tápközegben. A kapott tenyészetet sterilizáljuk és az említett oxidációs baktériumok táptalajához adjuk 0,5-5,0 térfogat% arányban, ezzel elősegítjük az oxidációs baktériumok növekedését. A táptalajban így előállított és felhalmozott 2-keto- L-gulonsavat ismert módon nyeljük ki és tisztítjuk. A 2-keto-L-gulonsavat izolálhatjuk, mint szabad savat, vagy izolálhatjuk például nátrium-, kálium-, kalcium- vagy ammóniumsóként is. Izolációs módszerként alkalmazhatjuk például azt az eljárást, amely szerint a baktériumsejteket a táptalajtól szűréssel, vagy szükség szerint centrifugálással választjuk el és a fennmaradó oldatot adott esetben aktív szénnel történő kezelés után besűrítjük, a kivált kristályokat szűréssel elválasztjuk és átkristályosítás után kapjuk a céltermékeL Alkalmazhatunk ezenkívül oldószeres extrakciót, kromatográfiát, kisózást és hasonló eljárásokat. Ezeket az eljárásokat önmagukban vagy alkalmas kombinációjukban esetleg ismételve is alkalmazhatjuk. Amikor a 2-keto-L-gulonsavat szabad sav formájában nyerjük ki, átalakíthatjuk például nátrium-, kálium-, kalcium-, ammónium- vagy hasonló sójává, amikor pedig sóként nyerjük ki, megfelelő módszerekkel átalakíthatjuk szabad savvá vagy egyéb sójává. A táptalajban előállított 2-keto-L-gulonsavat nagy teljesítményű folyadék kromatográfiával határozzuk meg a következő körülmények között: A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás mérés körülményei: HPLC: 655A rendszer (Hitachi Seisakusho, Japán terméke), Oszlop: SCR 101H (szulfonált polisztirolgén), 300*7,9 mm (Simadzu Seisakusho, Japán terméke), Áramlási sebesség: 0,8 ml/perc (nyomás 50 kg/cm2), Mozgó fázis: híg kénsav (pH-2,1), Detektor. UV (214 nm) és differenciáik refraktométer. Retenciós idő: 7,20 perc a 2-keto-L-gulonsavnál és 8,33 perc az L-szorbóznál. A továbbiakban néhány példán keresztül közelebbről is bemutatjuk a találmányt A példákban a táptalajra alkalmazott %-ok tömeg/térfogat%-ot jelentenek, kivéve, ha másként adjuk meg. A kitermelés az L-szorbóz 2-keto-L-gulonsavvá történő moláris konverzióját jelenti. 1. példa 1. táblázat Ferde táptalaj (g/1) D-szorbit 25 Pepton 10 Élesztőkivonat 10 CaCOj 2 Agár 20 pH-7,0. 20 ml oltótáptalajt amelynek összetétele 2,0% D-glukóz, 1,0% pepton, 1,0% szárított élesztő és 2,0% CaCOj (Akadama, Shiraishi Calcium K. K., Japán terméke), 200 ml-es Erlenmeyer-lombikba helyezünk és 120 *C-on 20 percig autoklávban kezeljük azt. A lombikot egy kacsnyi Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s törzzsel beoltjuk (IFO 14 464, FERM BP- 1130), amelyet előzőleg az 1. táblázat szerinti ferde táptalajon növesztettünk 30 *C-on 3 napon keresztül, és rázással (200 fordulat/perc) tenyésztünk tovább 30 ‘C- on 2 napon keresztül. A kapott 2 ml tenyészetet a fentebb már ismertetett tápközegbe visszük és azonos körülmények között tenyésztjük, így egy második oltótenyészetet kapunk. 25 ml fermentációs tápközeget, amelynek összetétele 2,0% CSL, 0,5% szárított élesztő, 0,3% ammóniumszulfát, 0,05% Na2S203*5H20, 0,1% FeS0<*7H20, 0,005% CeClj*7H20,3,5% CaCOj (Akadama) és 9,5% L-szorbóz (amelyet külön sterilizáltunk), egy 200 mles Erlenmeyer-lombikba teszünk, és azt 120 'C-on 20 percig autoklávban kezeljük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
