203787. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
1 HU 203 787 B 2 (Se), ittriumot (Y), lantánt (La), cériumot (Ce), prazeodímiumot (Pr), neodímiumot (Nd), szaraáriumot (Sm), europiumot (Eu), gadoliniumot (Gd), terbiumot (Tb), diszpróziumot (Dy), holmiumot (Ho), erbiumot (Er), túliumot (Tm), itterbiumot (Yb), és lutéciumot (Lu). Ezeket a ritkaföldfém-elemeket alkalmazhatjuk fémpor vagy fémtömb formájában, vagy vegyOletfoimában is adhatjuk a tápközeghez, így például-kloridjuk, karbonátjuk, szulfátjuk, nitrátjuk, oxidjuk vagy oxalátjuk formájában. Az egyes ritkaföldfémeket alkalmazhatjuk önmagukban vagy két vagy több ritkaföldfémet kombinálhatunk. Például cérium-karbonátot és lantán-kloridot együttesen is alkalmazhatunk. Ezenkívül a megfelelő elemek izolálása és tisztítása során kapott nyerstermékeket is alkalmazhatjuk. A tápközeghez adagolt ritkaföldfém mennyiségét úgy kell megválasztani, hogy az semmiképpen se gátolja az alkalmazott mikroorganizmus növekedését. Általában hatékony mennyiségként 0, 000001 és 0,1% (tömeg/térfogat), előnyösen 0,0001 és 0,05% (tömeg/térfogat) adható meg. Ami a ritkaföldfém-elemnek a táptalajhoz való hozzáadásának módját illeti, adagolhatjuk az elemet előzetesen a táptalajhoz, adagolhatjuk időszakosan vagy a tenyésztés alatt folyamatosan. A találmány szerinti eljárásban a kiindulási anyagot, vagyis az L-szorbózt adagolhatjuk a táptalajhoz teljes mennyiségében a tenyésztés kezdetekor, vagy adagolhatjuk több részletben vagy folyamatosan a folyékony táptalajhoz. Az L-szorbóz koncentrációja a táptalajban a táptalajhoz viszonyítva 2 és 40% (tömeg/térfogat), előnyösen 5-30% (tömeg/térfogat) közötti. A fenti oxidációs baktériumok tenyésztéséhez a táptalajban olyan tápforrásokat lehet alkalmazni, amelyeket a baktréiumtörzsek fel tudnak használni, vagyis szén-, nitrogénforrásokat, szervetlen sókat, szerves sókat és nyomelemeket Szénforrásként az L-szorbóz önmagában is alkalmazható. Ezenfelül kiegészítő szénforrásként például alkalmazhatunk glukózt, fruktózt, glicerint, szacharózt laktózt, maltózt, melaszt és hasonlókat. A felhasználható nitrogénforrások között megemlítjük például a különböző ammóniumsókat (például ammónium-szulfát, ammónium-nitrát, ammónium-klorid, ammónium-foszfát), szervetlen vagy szerves nitrogéntartalmú vegyületeket, például kukoricaáztató folyadékot (ezt a továbbiakban CSL-nek nevezzük), péptont, hűskivonatot élesztőkivonatot szárított élesztőt, szójabablisztet, őrölt gyapotmagot, karbamidot és hasonlókat. Szervetlen sóként a fentebb említett ritkaföldfémeken kívül kálium-, nátrium-, kalcium-, magnézium-, vas-, mangán-, kobalt-, cink-, réz- és foszforsav-sókat alkalmazhatunk. Nyomokban alkalmazandó tápelemként természetesen koenzim A-t, pantoténsavat, biotint, tiamint és ríboflavint adagolhatunk, ezek az anyagok lényeges növekedési faktorok a fent említett baktériumok számára. Ezenkívül adhatunk még a táptalajhoz flavinmononukleotidot (a továbbiakban FMN-nek nevezzük), amely elősegíti a növekedést és a 2-keto-L-gulonsav termelését, egyéb vitaminokat, L-ciszteint, L-glutaminsavat, nátrium-tioszulfátot és hasonlókat, akár vegyület, akár a vegyületeket tartalmazó természetes anyag formájában. Ezeket a táptalaj-komponenseket hozzáadhatjuk a táptalajhoz egyszerre előzetesen, vagy egy részüket, vagy a teljes mennyiséget adagolhatjuk időszakosan vagy folyamatosan a folyékony táptalajhoz. Ami a tenyésztés módját illeti, alkalmazhatunk stacionárius kultúrát, rázott kultúrát vagy kevert kultúrát, vagy hasonlót. Nagy mennyiségtl termeléshez azonban az úgynevezett süllyesztett kultúra a legelőnyösebb. A tenyésztési körülmények természetesen függenek az adott baktériumtörzstől, az adott táptalaj-összetételtől és hasonlóktól, vagyis minden egyes esetre úgy kell őket megválasztani, hogy a célterméket a legnagyobb hatékonysággal lehessen előállítani. Például a tenyésztési hőmérséklet előnyösen 25-35 *C közötti, és a táptalaj pH-ja előnyöen 5 és 9 közötti. Ha ilyen körülmények között végezzük a tenyésztést mintegy 10-120 órán keresztül, a 2-keto-L-gulonsav a legnagyobb koncentrációban képes felhalmozódni. Ebben az esetben, mivel a pH a céltermék felhalmozódásával csökken, megfelelő bázikus anyagot, például nátrium-hidroxidot, kálium-hidroxidot vagy ammóniát adagolhatunk, hogy a pH-t mindig a 2-keto-L-gulonsav mikrobiológiai előállításához szükséges optimális értéken tartsuk. Az optimális pH-érték fenntartása érdekében megfelelő puffert is adagolhatunk a táptalajhoz. A találmány szempontjából, ha a Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikrooiganiz-l must ritkaföldfém jelenlétében folyékony L-szorbózt tartalmazó táptalajban tenyésztünk annak érdekében, hogy 2-keto-L-gulonsavat termeljünk és halmozzunk fel a talajban, a felhalmozott 2-keto-L-gulonsav menynyisége lényegesen nagyobb lesz, ha a fent említett oxidációs baktériumot más mikroorganizmussal együtt használjuk, mintha a Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmust egyedül alkalmazzuk. Az együttes alkalmazásra megfelelő baktériumok közül példaként megemlítjük a Bacillus, Pseudomonas, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Xanthomonas, Flavobacterium, Micrococcus, Escherichia nemzetséghez tartozó baktériumokat és hasonlókat Közelebbről a következő baktréiumokat nevezzük meg példaként: Bacillus cereus EFO 3131, Bacillus licheniformis IFO12 201, Bacillus megaterium IFO 12 108, Bacillus pumilus IFO 12 090, Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022, Bacillus subtilis EFO 13 719, Bacillus circulans EFO 3967, Pseudomonas trifolii IFO 12 056, Pseudomonas maltophilia IFO 12 692, Protens inconstans EFO 12 930, Citrobacter freundii IFO 13 544, Enterobacter cloacae IFO 3320, Erwinia herbicola IFO 12 686, Xanthomonas pisi IFO 13 556, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
