203785. lajstromszámú szabadalom • Biokémiai eljárás Micromonospora fajok transzformálására, és az alkalmas plazmidvektorok előállítására
1 HU 203 785 B 2 agar, P pufferben) eloszlatva szélesztettük szilárd táptalaj (10,3% szacharóz, 0,025% K2S04,1,012% MgCl2*6H20, 1,0% glükóz, 1,0% tropton, 0,2% v/v% nyomelemoldat (1/2 példa), 2,6% Difco-agar, autoklávozás után 20 mM CaClj, 0,005% KH2PO4, 25 mM Tris-HCl pH-7,6) felszínére. A protoplasztokat 30 *C-on regeneráltattuk 48 órán át, majd 20 pg/ml tiosztreptonnal felülrétegeztük őket, és a sejtek inkubálását a továbbiakban 35 °C-on folytattuk. A csak PEG-kezelt, de nem transzformált protoplasztok nem szelekciós táptalajon 72-96 óra múlva regenerálódnak. A vízzel hígított protoplasztokból lO^-t szélesztve nem kapunk telepeket. A szelektív táptalajon a transzformáns telepek 7-14 nap múlva nőnek ki. A transzformáció hatékonysága 1—8* 10-3 transzformáns/regenerált protoplaszt, illetve 20 transzformáns/|ig DNS. 9. példa A Micromonospora purpurea ssp. luriduslpSE8 jellemzése A 8. példában kapott tiosztrepton-rezisztens Micromonospora purpurea telepeket szelektív, tiosztreptont tartalmazó táptalajon szaporítottuk, majd a micéliumból plazmidot izoláltunk. A plazmidizolálást a Streptomyces fajoknál ismert módon [Hopwood et al.: Genetic manipulation of Streptomyces, The John Innes Foundation (1985)] végeztük, az egyetlen eltérés az, hogy a lizozim-koncentráció a Micromonospora fajok esetén 4 mg/ml. Az izolált plazmidot 0,7%-os agarózgélben elektroforetizáltuk az eredeti, bevitt pSE8 plazmiddal együtt. Aplazmidokat az agarózgélből nitrocellulóz-filtene vittük és ezekhez az 5. példában leírtak alapján hibridizáltuk az a32P ATP-vel radioaktívan jelzett pSE8 plazmidot. ATio® Micromonospora purpurea telepekből izolált plazmid az agaróz gélelektroforézis alapján azonos méretű a bevitt pSE8 plazmiddal, és hibridizált ugyanehhez a plazmidhoz (5. ábra). Elvégeztük ugynezt a kísérletsort a plazmidok restrikciós enzimekkel történő emésztése után is, amelye megerősítette, hogy a Tio® Micromonospora purpurea telepek a pSE8 plazmidot tartalmazzák. 10. példa A Micromonospora purpurea ssp. luridus/pSG4 transzformáns előállítása A Micromonospora purpurea ssp. luridus sejtek tenyésztése, a sejtekből protoplasztok képzése a 8. példában leírtak szerint történt, a transzformációhoz 1-10 pg pSG4 plazmidot használtunk. A transzformáció hatékonysága ~ 1CP transzformáns/(Jg DNS volt, vagyis a pSG4 plazmidban levő 4,0 kb Micromonospora DNS növelte a transzformáció hatékonyságát. 11 11. példa A Micromonospora purpurea ssp. LuriduslpSG4 jellemzése A 10. példában kapott tiosztrepton-rezisztens Micromonospora purpurea telepeket szelektív táptalajon szaporítottuk, majd a micéliumból plazmidot izoláltunk (9. példa). A plazmid restrikciós térképét elkészítettük, és öszszehasonlítottuk az eredeti, bevitt pSG4 plazmid restrikciós térképével. Ez alapján a 10. példában kapott Tio® Micromonospora purpurea telepek a pSG4 plazmidot tartalmazzák. 12. példa A Micromonospora purpurea ssp. luridus/pSGES transzformáns előállítása A Micromonospora purpurea ssp. luridus sejtek tenyésztése, a sejtekből protoplasztok képzése a 8. példában leírtak szerinti történt, a transzformációhoz 1-10 pg pSGES plazmidot használtunk. A transzformáció hatékonysága 102 transzformáns/pg DNS volt, vagyis a pSGE5 plazmidban levő 4,0 kb Micromonospora DNS növelte a transzformáció hatékonyságát. 13. példa A Micromonospora purpurea ssp. luridus/pSGES jellemzése A12. példában kapott tiosztrepton-rezisztens Micromonospora purpurea telepeket szelektív táptalajon szaporítottuk, majd a micéliumból plazmidot izoláltunk (9. példa). A plazmid restrickós térképét elkészítettük és összehasonlítottuk az eredeti, bevitt pSGE5 plazmid restrikciós térképével. Ez alapján a 12. példában kapott Tio® Micromonospora purpurea telepek a pSGE5 plazmidot tartalmazzák. 14. példa Különböző Micromonospora fajok transzformálása a pSE8, pSG4, valamint a pSGE plazmidokkal, a transzformánsok jellemezése A különböző Micromonospora fajok esetében a protoplasztképzés céljából előállított sejtek tenyésztési körülményei eltérőek voltak: 1. Micromonospora rosea sejttenyészet előállítása Micromonospora rosea (MNG 00182) sejteket szilárd Cz-táptlajról (0,3% szacharóz, 0,1% KH2P04,0,2% Na- NOj, 0,05% MgSOWHzO, 0,05% KC1, 0,001% Fe- S04*7H20, 14% agar pH-7,0-7,3) 100 ml/500-s Erlenmeyer-lombik folyékony táptalajra (1,0% szójaliszt, 0,5% tripton, 2,4% oldható keményítő, 0,1% glükóz, 0,2% CaCÜ3 pH-7,0) oltunk. A 400 rpm, 35 °C-on 48 órán át készült sejttenyészetet használjuk kiindulási oltóanyagként a protoplasztképzésre alkalmas sejttenyészet elkészítéséhez. Ez a tenyészet 5-10 ml-enként szétosztva -30 “C-on tárolható egy-két évig. 250 ml-es Erlenmeyerlombikban levő 50 ml, 0,3% glicin és 0,005 M MgCl2- tartalmú C-tápoldatba (1,0% pepton, 1,0% tripton, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% glükóz pH-7,3) 5,0 ml fagyasztott inokulum sejttenyészetet oltunk, majd 400 rpm, 33 ‘C- on 48-72 órán át végezzük a tenyésztést. 2. Micromonospora danubiensis sejttenyészet előállítása Micromonospora danubiensis (MNG 00171) sejteket szilárd Cz-táptalajról (14/1 példa) 50 ml/500-s Erlenmeyer-lombik folyékony táptalajra (2,5% bur5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
