203785. lajstromszámú szabadalom • Biokémiai eljárás Micromonospora fajok transzformálására, és az alkalmas plazmidvektorok előállítására
1 HU 203 785 B 2 gonyakeményítő, 0,7% kukoricalekvár, 0,35% (NHO2SO4,0,5% NaCl, 0,8% CaC03 pH-7,2) oltunk. A 400 rpm, 28 ‘C-on, 48 órán át készült sejttenyészetet használjuk kiindulási oltóanyagként a protoplasztképzésre alkalmas sejttenyészet elkészítéséhez. Ez a tenyészet 5-10 ml-enként szétosztva -30 ‘C-on tárolható egy-két évig. 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50 ml, 0,4% glicin és 0,005 M MgCL-tartalmú C-tápoldatba (14/1 példa) 5,0 ml fagyasztott inokulum sejttenyészetet oltunk, majd 400 rpm, 25 ‘C-on 48-72 órán át végezzük a tenyésztést. 3. Micromonospora inyoensis sejttenyészet előállítása Micromonospora inyoensis (NRRL 3292) sejteket szilárd Cz-táptalajról (14/1 példa) 50 ml/500-s Erlenmeyer-lombik folyékony táptalajra (0,3% húskivonat, 0,5% tropton, 0,5% élesztőkivonat, 0,1% dextrose, 2,4% burgonyakeményítő, 0,2% CaC03 pH-7,0) oltunk. A 400 rpm, 28 ‘C-on 48 órán át készült sejttenyészetet használjuk kiindulási oltóanyagként a protoplasztképzésre alkalmas sejttenyészet elkészítéséhez. Ez a tenyészet 5-10 ml-enként szétosztva -30 ‘C-on tárolható egy-két évig. 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50 ml, 0,3% glicin és 0,005 M MgCL-tartalmú C-táptalajba (14/1 példa) 5,0 ml fagyasztott inokulum sejttenyészetet oltunk, majd 400 rpm, 25 °C-on 48-72 órán át végezzük a tenyésztést. 4. Micromonospora zionensis sejttenyészet előállítása Micromonospora zionensis (NRRL 5466) sejteket szilárd Cz-táptalajról (14/1 példa) 100 ml/500-s Erlenmeyer-lombik folyékony táptalajra (1,0% szójaliszt, 0,5% tripton, 2,4% oldható keményítő, 0,1% glükóz, 0,2% CaC03 pH-7,0) oltunk. A 400 rpm, 28 ‘C-on 48 órán át készült sejttenyészetet használjuk kiindulási oltóanyagként a protoplasztképzésre alkalmas sejttenyészet elkészítéséhez. Ez a tenyészet 5-10 ml-enként szétosztva -30 °C-on tárolható egy-két évig. 250 ml-es Erlenmeyerlombikban levő 50 ml 0,3% glicin és 0,005 M MgCl3-tartalmú C-tápoldatba (14/1 példa) 5,0 ml fagyasztott inokulum sejttenyészetet oltunk, majd 400 rpm, 25 ‘C-on 48-72 órán át végezzük a tenyésztést. A fent leírtak alapján kapott micéliumból a protoplasztok képzése, a protoplasztok transzformációja, regenerálása, majd tiosztreptont tartalmazó fedőagarral való felülrétegzése a 8. példában leírtak szerint történt. A transzformációhoz 0,5 pg - 10|ig pSE8, pSG4, valamint pSGE5 plazmidot használtunk, a transzformáció hatékonysága a különböző fajoknál nem mutatott kiugró eltéréseket: 5-50 transzformáns/pg plazmid DNS. A tiosztrepton-rezisztens Micromonospora törzsekből a 9. példa alapján plazmidot izoláltunk, és az ott leírtak szerint ellenőriztük, hogy ezek a plazmidok azonosak az eredeti, bevitt plazmidokkal. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás Micromonospora, Streptomyces és adott esetben E. coli gazdasejtek transzformálására alkalmas pSE8, pSG4, pSGE5 hibridvektor előállítására, azzal jellemezve, hogy- BgUI restrikciós enzimmel linearizált pU702 plazmidot,- BamHI, vagy PstI restrikciós enzimmel linearizált pSP64 plazmidot, és/vagy Micromonospora eredetű gentamicin-rezisztenciagénnel rendelkező DNS- fragmentumot kapcsolunk össze. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-fragmentumok összekapcsolását T4 DNS- ligázzal végezzük. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás a pSE8 hibridvektor előállítására, azzal jellemezve, hogya pSP64 plazmidot BamHI restrikciós enzimmel a pD702 plazmidot BgUI restrikciós enzimmel linearizáljuk és a kapott fragmentumokat DNS-ligázzal összekapcsoljuk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. ábra szerinti pSE8 vektort PstI restrikciós enzimmel hasítjuk, Micromonospora purpurea ssp. luridus törzsből DNS-t izolálunk, a DNS-t PstI restrikciós enzimmel emésztjük és a kapott fragmentumokat összekapcsoljuk a linearizált pSE8 plazmiddal, majd a transzformáció után gentamicin-rezisztens telepeket izolálunk. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás a pSGE5 hibridvektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3. ábra szerinti pSG4 vektort PstI restrikciós enzimmel részlegesen emésztjük és a kapott linearizált pSG4 vektort összekapcsoljuk a PstI restrikciós enzimmel linearizált pSP64 plazmiddal. 6. Eljárás Micromonospora gazdasejtek transzformálására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított hibridvektort juttatunk Micromonospora protoplasztokba, majd a protoplasztokat a regenerálódáshoz és a hibridvektomak a gazdasejtben való fennmaradásához szükséges szelektív körülmények között tenyésztjük. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Micromonospora gazdasejtekbe pSE8, pSG4, pSGE5 hibridvektort viszünk be és a sejteket tiosztreptont és/vagy gentamicint tartalmazó szelektív táptalajon tenyésztjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 8
