203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 gáltatjuk szobahőmérsékleten, például 20-70 “C-on, különösen 50 ‘C-on. A találmány szerinti oligodezoxinukleotidok összekapcsolásához 5’-végen lévő hidroxicsoportra foszfátcsoportot viszünk. A foszfátcsoport bevitele (foszforilálás) önmagában ismert módon T* polinukleotid-kináz segítségével ATP jelenlétében történik. A kódoló és a komplementer szálból a találmány szerint előállított oligodezoxinukleotidok átfedő szekvenciákat tartalmaznak, amelyek legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedő bázispárt tartalmaznak. Ha ilyen oligodezoxinukleotidokat összekeverünk, a köztük kialakuló hidrogénkötések összetartják őket Az elálló, ragadós végek az el) és e2) reakciólépésnek megfelelően mátrixként (templátként) szolgálnak a második (komplementer) szál felépítéséhez, amit DNS-polimeráz, például DNS-polimeráz I, a DNS-polimeráz I Klenow-fragmentje vagy T4 DNS-polimeráz,vagy AMV reverz transzkriptáz végez a négy dezoxinukleozid-trifoszfát (dATP, dCTP, dGTP és dTTP) jelenlétében. A kiegészítésnél képződő DNS-duplexek, amelyek alatt különösen a (módosított) eglingén (el eljárásváltozat) vagy a teljes (módosított) eglingén (e2 eljárásváltozat) értendő, tompa végűek. A (módosított) eglingén el. eljárásváltozattal kapott fragmentjei a végeken olyan nukleotidszekvenciákat tartalmaznak, amelyeket a restrikciós endonukleázok képesek felismerni és elhasítani. A nukleotidszekvenciák és ennek megfelelően a restrikciós endonukleázok megválasztásától függően a a hasításnál teljesen bázispárosodott (tompa) végek („Blunt ends”) vagy ragadós DNS- szálat tartalmazó végek („staggered ends”) képződnek. A restrikciós felismerési szekvenciákat úgy választjuk meg, hogy a tompa végeket képző restrikciós endonukleázokkal kezelt DNS- fragmentek összekapcsolása, illetve a kohézív végek végek bázispárosodása és a ragadós DNS- szálakat tartalmazó DNS- fragmentek ezt követő összekapcsolása teljes (módosított) eglin- stmktúrgént eredményezzen. Két kettős szálú DNS-fragment összekapcsolása a donor-fragment 5’-végén foszfátcsoportot, az akceptor-fiagment 3’-végén szabad hidroxicsoportot igényel. A keletkező DNS-fragmentek már az 5’-végen foszforiláltak és ezeket önmagában ismert módon ligázzal, különösen T4 DNS-ligázzal kapcsoljuk össze. A találmány egyik előnyös kiviteli formájában a leírt módon állítjuk elő az eglin-C- vagy B-gén két fragmentjét, az eglin-C-gén esetében különösen a (Illa), ill. (IV) általános képletű Fj(C) és F2 fragmenteket és az eglin-B-gén esetében különösen a (Illb), ill. (IV) általános képletű Fi(B) és Fj fragmenteket. A szükség esetén alkalmas vektorok szubklónozható fragmentek a kapcsolódó végeken előnyösen mindig egy restrikciós endonukleáz, különösen Hpall, felismerési szekvenciáját tartalmazzák, ami miatt az említett restrikciós enzimmel való hasítás és a két fragment összekapcsolása után a korrekt eglint kódoló DNS-szekvencia képződik. Az 1. fragment a transzláció startjele (ATG) előtt és a 2. fragment a transzláció stopjele (pl. TAG) után kiegészítőig „terminális” restrikciós helyeket tartalmaz, amelyek a (módosított) eglingén, ill. a (módosított) eglingén fragmentjeinek alkalmas vektorba történő beépítését megengedik. A találmány különösen az eglin-C-gén (Illa), ill. (IV) általános képletű Fi(C) és F2 fragmentekből való előállítására vonatkozik, amely a Hpall restrikciós enzimmel való hasítás és összekapcsolás után korrekt eglin-C DNS-szekvenciát eredményez és amelyben Fi(C)-n a transzláció startjele előtt egy EcoRI restrikciós hely és Fz-n a transzláció stopjele után egy BamHI restrikciós hely található. Egy másik kiviteli formában (e2 reakciólépés) kétkét oligodezoxinukleotidot, amelyek alternatív módon a kódoló és a komplementerszálból származnak, legkevesebb 3, előnyösen 8-15 komplementerbázissal anelláljuk, DNS-polimerázzal, például a fentiek egyikével feltöltjük és T4 DNS-ligázzal (módosított) eglin-struktúrgénné kapcsoljuk össze. Eglingént tartalmazó expressziós vektorok előállítása A találmány továbbá olyan expressziós vektorokra vonatkozik, amelyek az eglint vagy módosított eglint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazzák, amelyeket egy expressziós kontrollszekvencia oly módon szabályoz, hogy ezzel az expressziós vektorral transzformált gazdában eglinaktivitású polipeptid termelődik. A találmány szerinti expressziós vektorok eglin-B-t, módosított eglin-B-t, módosított eglin-C-t vagy különösen eglin-C-t kódoló szekvenciát tartalmaznak. A találmány szerinti expressziós vektorokat például oly módon állítjuk elő, hogy az expressziós kontroliszekvenciát tartalmazó vektor-DNS-be oly módon illesztjük az eglint vagy módosított eglint kódoló DNS- szekvenciát, hogy ezt az expressziós kontrollszekvencia szabályozza. Az alkalmas vektor megválasztása a transzformációhoz tervbe vett gazdasejtekből következik. Alkalmas gazdák például a mikroorganizmusok, így az élesztők, például Sacharomyces cerevisiae, és különösen azok a baktériumtörzsek, amelyek nem tartalmaznak restrikciós vagy modifikációs enzimet, mindenekelőtt az Escherichia coli törzsek, például az E.coli X1776, E.coli HB101, E.coli W3110, E.coli HB101/LM1035, E.coli JA221(37) vagy E.coli K12 törzs 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus és mások, továbbá magasabb organizmusok sejtjei, különösen az elfogadott humán vagy állati sejtvonalak. Előnyös gazdamikroorganizmusok az E.coli említett törzsei, például az E.coli HB101 és E.coli JA221, továbbá a Saccharomyces cerevisiae. Alapvetően minden olyan vektor alkalmas, amely a találmány szerint DNS-szekvenciát a választott gazdában replikálja és kifejezi. Például az eglin- vagy módosított eglingént E.coli törzsben kifejező vektorként alkalmasak a bakteriofágok, például a ^-bakteriofág származékai, vagy plazmidok, így különösen a ColEl plazmid és származékai, például a pMB9, pSF2124, pBR317 vagy pBR322. A találmány szerinti előnyös vektorokat a pBR322 plazmidból vezetjük le. Az alkalmas plazmidok teljes repli-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
