203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 kációs kontrollszekvenciát tartalmaznak és egy markergént, ami az expressziós plazmiddal transzformált gazda szelekcióját és azonosítását egy fenotípusos bélyeg alapján lehetővé teszi. Az alkalmas maikergének a gazdának például rezisztenciát kölcsönöznek nehézfémekkel, antibiotikumokkal és hasonlókkal szemben. Továbbá a találmány szerinti előnyös vektorok a replikációs kontrollszekvencián és markergén- területeken kívül tartalmazzák a restrikciós endonukleázok felismerési szekvenciáit, úgyhogy ezekre a helyekre az eglingén és adott esetben az expressziós kontrollszekvencia beilleszthető. Az előnyös vektor, a pBR322 plazmid, intakt replikációs kontrollszekvenciát, tetraciklinnel és ampicillinnel szemben rezisztenciát kölcsönző markelgéneket (tét* és amp®) és egy sor csak egyszer előforduló felismerési szekvenciát tartalmaz restrikciós endonukleázok például PstI (az amp®-génben hasít, a tet*-gén érintetlen marad), BamHI, Hindl- II, Sáli (mind a tet®-génben hasítanak, az amp*-gén érintetlen marad), Nrul és EcoRI számára. A génexpresszió szabályozásához több expressziós kontrollszekvencia alkalmazható. Különösen a transzformálandó gazda erősen kifejeződő génjeinek expressziós kontrollszekvenciáit alkalmazzuk. A pBR322, mint hibridvektor és az E.coli, mint gazdamikroorganizmus esetében például a laktóz operon, triptofán operon, arabinóz operon és hasonlók a P-laktamázgén expressziós kontrollszekvenciái (amelyek többek között a promotert és a ribószomális kötőhelyet is tartalmazzák), a X-fág N génjének vagy az fd-fág burokfehéijegénjének megfelelő szekvenciái és mások alkalmasak. Míg a pBR322 plazmid már tartalmazza a ß-laktamazgén P-lac-gén) promoterét, a többi expressziós kontrollszekvenciát be kell vinni a plazmidba. A találmány szerint előnyös a triptofán operon (trp po) expressziós kontrollszekvenciája. A replikádéra és expresszióra élesztőben alkalmas vektorok élesztő-replikációs origót és az élesztő számára szelektív genetikai markert tartalmaznak. Az élesztő reprikációs origóját, például a kromoszómális autonóm replikálódó szegmentjét (ars) tartalmazó hibridvektorok, a transzformáció után az élesztősejten belül extrakromoszómálisak maradnak és a mitóziskor önállóan replikálódnak. Továbbá alkalmazhatunk az élesztő 2 p-plazmid-DNS-sel homológ szekvenciákat tartalmazó hibridvektorokat Ezek a hibridvektorok rekombinációval a sejten belül már meglévő 2 p-plazmidokba épülnek be vagy önállóan replikálódnak. A 2 p-szekvenciák, különösen a nagy transzformáció-gyakoriságú plazmidokhoz alkalmasak és nagyszámú másolat képzését biztosítják. Az élesztőhöz alkalmas jelzőgének mindenekelőtt azok, amelyek antibiotikus rezisztenciát kölcsönöznek a gazdának, vagy auxotróf élesztőmutánsok esetében, a gazda defektusát komplementáló gének. Megfelelő gének például cikloheximid antibiotikum elleni rezisztenciát kölcsönöznek vagy gondoskodnak a prototrofiáról auxotróf élesztőmutánsokban, ilyen például az URA3-, LEU2-, HIS3- vagy mindenekelőtt a TRP 1-gén. Továbbá az élesztő-hibridvektorok előnyösen a baktériumgazda, különösen E.co-U számára replikációs origót és egy markergént tartalmaznak, így a hibridvektorok és prekurzoraik konstruálása és klónozása egy baktériumgazdában történhet. Az élesztőben expresszióra alkalmas expressziós kontrollszekvenciák például a TRP1-, ADHI-, ADHII-, PH03-, vagy PH05-gén kontrollszekvenciái, továbbá a glükolízisben részt vevő promoterek, például a PGK- és a GADP/f-promoter. A találmány különösen olyan replikációra és fenotípusos szelekcióra alkalmas expressziós vektorokra vonatkozik, amelyek expressziós kontrollszekvenciát és eglint vagy módosított eglint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak, mimellett az említett DNS-szekvencia a transzkripció start- és stopjelével, valamint a transzláció start- és stopjelével együtt az említett expressziős kontrollszekvencia szabályozása alatt az említett expressziós plazmidban olyan elrendezésú, hogy az említett plazmiddal transzformált gazdában eglinaktivitású polipeptid fejeződik ki. Hatékony expressziót akkor érünk el, ha a struktúrgén az expressziós kontrollszekvenciához képest megfelelő leolvasási fázisban helyezkedik el. Az expressziós kontrollszekvenciát előnyös a fő-mRNS-start és a gént kódoló szekvencia ATG-je közötti tartományban, amely természetesen az expressziós kontrollszekvenciával össze van kötve (pl. a ß-lac-kódszekvencia, ha ß-lac-promotert alkalmazunk), előnyösen a saját transzlációs startjelét (ATG) és transzlációs stopjelét (pl. TAG) tartalmazó eglin- (ill. módosított eglin-) génnel összekapcsolni. Ez biztosítja a hatékony transzkripciót és transzlációt Például egy vektort, különösen a pBR322-t, restrikciós endonukleázzal hasítunk és adott esetben az így kapott linearizált vektor modifikálása után abba megfelelő restrikciós végekkel ellátott expressziós kontrollszekvenciát juttatunk. Az expressziós kontrollszekvencia a 3’-végen (a transzláció irányába) egy restrikciós endonukleáz felismerési szekvenciáját tartalmazza, úgy, hogy az expressziós kontrollszekvenciát tartalmazó vektor az említett restrikciós enzimmel emészthető és az illeszkedő végekkel rendelkező eglin- (vagy módosított eglin-) struktúigén beilleszthető. Ekkor két hibridplazmid keveréke képződik, amelyek a gént megfelelő, ill. nem megfelelő orientációban tartalmazzák. Előnyös az expressziós kontrollszekvenciát már tartalmazó vektort még egy második restrikciós endonukleázzal a vektor-DNS-en belül elhasítani és a képződött vektorfragmentbe a megfelelő végekkel ellátott struktúrgént beilleszteni. A vektoron előnyösen minden műveletet olyan módon végzünk, hogy a replikon és legalább egy maikergén működőképes, érintetlen maradjon. A találmány egyik előnyös kiviteli formájában egy pBR322-ből származó vektort, amely expressziós kontrollszekvenciával, különösen a triptofán operonéval (trp po) - amely a 3’-végen (a fő-mRNS-start és az első ATG között) egy előnyös kohézív végeket képző restrikciós endonukleáz, pl. EcoRI felismerési szekvenciáját hordozza - rendelkezik, az említett restrikciós endonukleázzal és a vektor-DNS részben egy tompa 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
