203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAsp ValHisPheLeuPro GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTCATTTCCTGCCGG CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCC f,(B) (mb) ProGluGlySerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGly CCGGAAGGTTCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGT GGCCTTCCAAGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGTTGGGTCCA ThrAsnValValAnsHisValProHisValGlyNON ACTAACGTTGTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG TGATTGCAACAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC F2 A találmány az eglin- és módosított eglingének 15 egyes szálú DNS-fragmentjeire is vonatkozik, különösen azokra, amelyek kémiai és/vagy enzimatikus módszerekkel eglin-, ill. módosított eglingénekké illeszthetők össze. A találmány elsősorban húsznál több, különösen 20-70 nukleotidot tartalmazó egyes szálú DNS- 20 fragmentekre vonatkozik. A találmány legelsősorban a példákban leírt egyes és kettős szálú DNS-fragmentekre vonatkozik. A DNS-szintézis módszereit S. A. Narang (11) foglalta össze. Az új szintézistechnikák mintegy 20 bázis 25 hosszúságú polinukleotidok előállítását teszik lehetővé jó kitermeléssel, nagy tisztaságban és viszonylag rövid idő alatt. A foszfodiészter módszerrel (12), a még hatékonyabb foszfotriészter módszerrel (13) vagy a foszfittriészter módszerrel (14) alkalmas védett nukleotidokat 30 kapcsolunk össze egymással. Az oligo- és polinukleotidok szintézise a szilárd fázisú módszerrel egyszerűsíthető, amelyben a nukleotidláncot alkalmas polimerhez kötjük. Itakura et al. (15) a szilárd fázisú szintézisben egyes nukleotidok helyett foszfotriészter módszerrel 35 kapcsolt trinukleotidokat alkalmaznak, amelyek így rövid idő alatt és jó kitermeléssel, például 31 bázist tartalmazó polinukleotiddá kondenzálhatnak. A tulajdonképpeni kettős szálú DNS kémiailag előállított rövid szegmentekből enzimatikusan állítható össze. Kho- 40 rana et al. (16) ehhez mindkét DNS-szálból származó átfedő polinukleotid-szekvenciákat alkalmaznak, amelyek helyes elrendezését a bázispárosodás biztosítja és ezeket utána a DNS-ligáz-enzim kapcsolja össze. További lehetőséget jelent az, ha mindkét DNS-szálból 45 származó rövid átfedő szegmentet tartalmazó egy-egy polinukleotid-szekvenciát a négy szükséges dezoxinukleotid-trifoszfát jelenlétében DNS-polimerázzal, például DNS-polimeráz-I-gyel, a polimeráz-I Klenowfragmentjével, T4 DNS-polimerázzal vagy AMV (avian 50 myeloblastosis vírus) reverz transzkriptázzal inkubálunk. Eközben a bázispárosodás a két polinukleotidszekvenciát a helyes elrendezésben tartja össze és azt az enzim a szükséges nukleotidokkal teljes kettős szálú DNS-sé egészíti ki (17). Itakura és munkatársai leírják 55 (18), hogy ezen az elvi alapon DNS-polimeráz-I (Klenow-fragment) jelenlétében 4 kémiailag szintetizált 39-42 bázishosszúságú fragmentumból a humán leukocita-interferon ct2-gén 132 bázispár hosszúságú szegmentje állítható össze, mimellett a kémiai szinté- 60 (TV) zisben 40%-os megtakarítást értek el a csak ligázt alkalmazó módszerrel szemben. A találmány mindenekelőtt eljárás olyan DNS-ek, amelyek az eglineket vagy a módosított eglineket kódolják, a gazdasejtekben expresszióra alkalmasak és végeik vektorokba történő beépítést tesznek lehetővé, és fragmentjeik előállítására azzal jellemezve, hogy a) valamely alkalmas védett dezoxinukleotidot szilárd hordozóhoz kapcsolunk, b) alkalmas védett di-, tri- vagy tetranukleotidokat állítunk elő a foszfor-triészter vagy a foszfit módszerrel, c) a hordozóhoz kötött dezoxinukleotidot vagy oligodezoxinukleotidot alkalmas, védett mono- vagy [a b) pont szerint előállított] di-, tri- vagy tetranukleotiddal kapcsolunk össze a foszfotriészter vagy a foszfit módszer segítségével, d) a c) pont szerint előállítható, hordozóhoz kötött kb. 20-70 bázishosszúságú oligodezoxinukleotidokat a hordozóról lehasítjuk, adott esetben tisztítjuk, a védőcsoportokat eltávolítjuk és az 5’-végen a szabad hidroxicsoportot foszforizáljuk, el) a kódoló és a komplementer szál két, egyenként kb. 20-70 bázishosszúságú, legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedő bázispárt tartalmazó oligodezoxinukleotidját anelláljuk és a négy dezoxinukleozid-trifoszfát jelenlétében DNS-polimerázzal kettős szálú DNS-szegmentekké (az eglin- vagy módosított eglingén fragmentumaivá) egészítjük ki, és adott esetben 2, a d) eljárásváltozat szerint foszforilált alkalmas végekkel rendelkező kettős szálú DNS-szegmentet ligázzal eglin- vagy módosított eglin-struktúrgénné kapcsolunk össze, vagy 2 előállítható, kettős szálú DNS-szegmentet alkalmas vektorokban szubklónozunk, majd a d) eljárásváltozat szerint föszforilálunk és ligázzal az eglin vagy módosított eglin struktúrgénjévé kapcsoljuk össze, vagy e2) alternatív módon a kódoló és a komplementer szál 2, egyenként kb. 20-70 bázishosszúságú, legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedő bázispárt tartalmazó oligodezoxinukleotidját anelláljuk, a négy dezoxinukleozid-trifoszfát jelenlétében DNS-polimerázzal feltöltjük és ligázzal az eglin vagy a módosított eglin struktúrgénjévé kapcsoljuk össze. 7
