203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 b) Eglin-B-aktivitású polipeptidek szintézise A 21. a) példában leírttal analóg módon a rekombinált eglin-B-gént tartalmazó 6 klón mindegyikét, éspedig E.coli HB101 pML199 E.coli HB101 pML200 E.coli HB101 pML201 E.coli HB101 pML202 E.coli HB101 pML203 E.coli HB101 pML204 megvizsgáljuk eglin-B-aktivitás képződésére. Az említett kiónokat a leírt módon L-közegben tenyésztjük és utána M9-közegbe visszük át. 0,9-1,0 optikai sűrűség elérése után a sejteket összegyűjtjük, oldjuk és váltakozó lefagyasztással és felengedéssel elroncsoljuk. Az elegyeket centrifugáljuk, és a felülúszót humán leukocita-elasztáz (1) gátlásának mérésével vizsgáljuk eglin-B-aktivitásra. A következő aktivitásértékeket kapjuk: Baktériumkivonat Eglin-B-aktivitás pg/ml kultúra E.coli HB101 pML 199 3,2 E.coli HB101 pML200 3,1 E.coli HB101 pML 201 3,8 E.coli HB 101 pML 202 3,5 E.coli HB 101 pML 203 3,3 E.coli HB101 pML 204 3,3 22. példa E.coli HB101 pML147 törzs tenyésztése 20 ml L-közegbe (ld. 21. példa) jól kinőtt agarlemezről E.coli HB101 pML147 sejteket oltunk és rázógépre (körkörös) tett rázólombikban 150 f7p-en 37 *C- on 12 órán át rázzuk. Ebből az előtenyészetből 5 ml-t 120 ml M9-tápközegbe viszünk. Ezt a kultúrát 250 f/p-en és 37 °C-on rázzuk. Kb. 8-10 óra után eglin- C-aktivitású polipeptidre a kultúra eléri a legnagyobb titert és összegyűjtjük a sejteket. 23. példa Az eglin-C-aktivitás kimutatása Eglin-C-aktivitású polipeptidet tartalmazó mintából (vö. 21. és 22. példa) kb. 5—10 pl-t 1 cm2-es nitrocellulóz-papírra (NZ) (Biorad) cseppentünk és 30 percen át szobahőmérsékleten szárítjuk. Utána az NZ-t 1 órán át 37 °C-on 0,01 M Tris*HCl (pH 8) és 0,9% NaCl-oldattal készített 3% szérumalbuminnal inkubáljuk. Ezt követően az NZ-t 0,01 M Tris*HCl (pH 8) és 0,9% NaCl oldatában mossuk 30 percen keresztül, majd az oldatot ötször cseréljük. Utána a mosott NZ-t 25 “C-on 2 órán át olyan 0,01 M Tris*HCl (pH 8) és 0,9% NaCl-oldattal készített 3% szérumalbumin- oldattal inkubáljuk, amely 2 pg/ml eglin-C elleni antitestet (nyúlból előállított, vagy monoklonális antitest) tartalmaz. Utána az NZ- t a fenti módon mossuk. Ezt követően az NZ-t 2-3 órán át 25 “C-on 3% szérumalbumin, 0,01 M Tris*HCl (pH 8) és 0,9% NaCl összetételű oldattal kezeljük, amely 0,2 pCi/ml „123I-Protein-A”-t (radioaktív jód-125 izotóppal jelzett Protein-A készítmény, fajlagos aktivitás 89,8 (iCi/mg, gyártó: New England Nuclear Corporation, USA) tartalmaz. Utána az NZ-t a fenti módon ismét mossuk, szárítjuk és gamma-számlálóban (Multi Gamma, 1260 gamma counter, LKB, Wallace) meghatározzuk a kötött radioaktivitást, ami az NZ-n lévő eglin-C-aktivitású polipeptid mértéke. Egy alternatív eljárásban a fenti mintát SDS-poliakrilamid- gélelektroforézisnek (PAGE) vetjük alá [vö. (7)]. A PAGE- elektroforetogrammot elektroblottinggal NZ-re visszük át. Utána az NZ-t a fenti módon kezeljük és/vagy egy éjszakán át röntgenfilmmel (Fuji) autoradiografáljuk. Az NZ-n eglin-C-aktivitású polipeptideket tartalmazó helyek a filmen fekete foltokként jelennek meg. 24. példa Na-acetil-eglin-C izolálása és tisztítása monoklonális antitest-oszlop segítségével a) Polipeptidoldat készítése a monoklonális antitestoszlophoz 150 ml táplevest (a 22. példa szerint kaptuk) 4 °C-ra hűtünk és a sejteket centrifugálással (5000 f/p, 15 perc, Sorvall RC 3B) elválasztjuk. A tiszta felülúszó nem tartalmaz eglin-C-aktivitást. Ezt követően a sejteket 12 ml oldópufferben [50 mM Tris»HCl (pH 8)], 30 mM NaCl-lel szuszpendáljuk. Ehhez az elegyhez 15 mg lizozimot (Boehringer) adunk és utána 30 percen át 4 °C-on tartjuk. Utána a sejteket négyszeri lefagyasztással folyékony nitrogénben és ezt követő felengedéssel 37 °C-ra elroncsoljuk. Ezt követően 30 percen át 16 000 fip-en 4 ‘C-on centrifugáljuk. A felülúszó tartalmazza az Na- acetil-eglin-C aktivitást. A felülúszóban (15 ml) 7,7 g szilárd ammónium-szulfátot oldunk. A zavaros elegyet 4 ”C-on 30 percre állni hegyjuk és utána centrifugáljuk (ld. fent). A nedves üledéket 1 ml 0,05 mM Tris*HCl (pH 8) pufferben oldjuk és megkapjuk a kívánt polipeptidoldatot. b) Az bP-acetil-eglin-C tisztítása monoklonális antitest-oszlopon Az 1K-F299-22-10 monoklonális antitest-oszlopot (ágytérfogat 0,8 ml, lásd alább) 0,05 mól Tris*HCl-lel (pH 8) hozzuk egyensúlyba. A fenti polipeptidoldatot 0,5 ml-es adagokban 4 °C-on visszük fel a 7 ml/óra átfolyási sebességű oszlopra. Utána 10 ml 0,05 M Tris*HCl (pH 8) pufferrel mossuk. Az első frakciók a nem adszorbeált polipeptideket tartalmazzák, ezeket eldobjuk. Ezt követően az oszlopot 0,05 M Tris*HClben (pH 8) oldott 5 ml 5 M nátrium-tiocianáttal (Merck) mossuk és a kapott frakciókat HLE-teszttel (1) vizsgáljuk N“-acetil-eglin-C aktivitásra. A polipeptideket tartalmazó frakciókat OD280 méréssel határozzuk meg. A 19. és 20. frakciók tartalmazzák az ^-acetileglin-C aktivitást: ezeket -20 “C-on vagy a további feldolgozásig jeges fürdőben tartjuk. Az N“-acetil-eglin-C aktivitás a 19. frakcióban 61 pg/ml és a 20. frakcióban 49 pg/ml. Utána a frakciókat dializáljuk vagy Sephadex-G 25-ön (Pharmacia) sómentesítjük. Az SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis (7) az N-acetil-eglin-C molekulasúlyára kb. 8100 daltont adott. Az 1K-F299-22-10 monoklonális antitest-oszlop segítségével az N“-acetil-eglin-B, eglin-C és eglin-B tisztításával analóg módon tisztítható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 30
