203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 c) Az IK-F299-22-10 monoklonális antitest-oszlop készítése A) Egerek immunizálása Liofilizált, tiszta, természetes eglin-C-t (6 mg) kevés 0,1%-os ecetsavban oldunk és utána foszfátpufferrel készített konyhasóoldattal egészítjük ki és a pH-t 7,2-re állítjuk úgy, hogy a végkoncentráció 2 mg/ml legyen. Ennek az antigénoldatnak az adagjait azonos mennyiségű Freund adjuvánssal, inkomplett Freund adjuvánssal vagy foszfátpufferrel készített sóoldattal elegyítjük és emulgeáljuk. Balb/c nőstény egereket (8-14 hetesek, a sisselni állatfarmról származók, Svájc) 100 pg eglint tartalmazó emulzió mancsba adott injekciójával immunizálunk. A következő hat hét folyamán minden héten további 100 pg eglint emulgeálunk a fenti módon, de inkomplett Freund adjuvánsban subcutan és végül 200 pg eglint foszfátpuffeirel készített sóoldatban intravénásán injektálunk. Négy nappal később kivesszük a lépet a fúzióból. B) A hibridoma és az antitest-teszt előállítása A hibridomasejteket a kapott lépsejtek SP 2/0 myeloma-sejtvonallal való összeolvasztásával állítjuk elő. 108 lépsejtet és 107 myelomasejtet alkalmazunk. A fúziót a leírt módon (9,26) végezzük. Az anti-eglin-C aktivitást a hibridoma felülúszóban kompetitiv radioimmunassay segítségével határozzuk meg [RIA, (10)]. Ebből a célból az eglin-C-t a szokásos klóramin-T módszerrel radioaktív 123I-dal jelöljük (30 000 beütés/perc). Egy éjszakán át tartó inkubálással poüsztirol mikrotitrálólemez vájataiban poliklonális nyúl anti-eglin-C antitestet rögzítünk. Hozzávetőleg a radioaktív eglin-C 50-70%-át ehhez a szilárd fázisú antitesthez kötjük. A kapott 45 hibridomakultúra közül 32-nek a felülúszója ezt a kötődést több, mint 50%-ban szignifikánsan gátolta. Az erősen gátló felülúszók közül kettőt, ill. ezek hibridomasejtjeit 299S18 és 299S22 jelöléssel látjuk el és további karakterizálásra kiválasztjuk. Ezeket először a határhígítási módszerrel klónozzuk, mimellett a 299S18 négy és a 299S22 kilenc pozitív kiónt eredményez, amelyek közül kiválasztjuk a 299S18-20,299S22-1 és 299S22-10 kiónokat és azokat közelebbről karakterizáljuk. Az említett hibridomasejtvonalak Igi kappa szubtípusú monoklonális antitesteket (ugyanolyan jelöléssel) termelnek. C) Az anti-eglin-C antitest izolálása és tisztítása ascitesből Balb/c egereket 0,4 ml Pristan-nal (Carl Roth) intraperitonálisan előkezelünk. Egy héttel később 2-5* 106 klónozott hibridomasejtet injektálunk intraperitonálisan. Mindegyik egérből ismételten ascites folyadékot veszünk és -80 *C-on lefagyasztjuk. Az összegyűjtött folyadékot felengedjük és 30 percen át 4 ‘C-on 16 000 f/p-en centrifugáljuk. A zsírt leszívjuk és a visszamaradó törmelékmentes felülúszóhoz lassú keverés közben 0 *C-on 0,9 térfogatekvivalens telített ammónium-szulfát-oldatot csepegtetünk. A kapott nyers immunglobulin-frakciót 0,1 M Tris*HCl (pH 8,2) pufferrel Sephadex-G 200 (Pharmacia) oszlopon visszük át a gyártó adatai szerint. Az aktív frakciókat egyesítjük és Amicon XM-50 szűrővel (Amicon) koncentráljuk. Ilyen módon a 299S18-20,299S22-1 és 299S22-10 monoklonális antí-eglin- C antitesteket kapjuk. D) Az 1K-F299-22-10 antitest-oszlop előállítása Affi-Gel 10-et (Bio-Rad) a gyártó adatai szerint hideg desztillált vízzel és pH 8-as kapcsolópufferrel (0,1 M NaHCCb) mosunk. A gél kapcsolópufferrel (1 ml) készített 50%-os szuszpenzióját műanyag csőbe viszszük, azonos mennyiségű, tisztított antitest-oldattal (19 mg 299S22-10 monoklonális anti- eglin-C antitest) elegyítjük és 4 órán át szobahőmérsékleten forgatjuk a csövet. Utána a gélt kapcsolópufferrel mossuk. A fennmaradt szabad, aktív helyeket úgy blokkoljuk, hogy a gélt ml- énként 0,1 ml 1 M etanol-amin-HCl-lel (ph 8,0) kezeljük, majd foszfátpufferrel készített, gél mlenként 10 mmól nátrium-azidot tartalmazó sóoldattal mossuk és abban tartjuk 4 ‘C-on. A kapcsolás fokát 280 nm-en végzett extinkcióméréssel határozzuk meg és ez 15-30 mg antítest/ml gél. A monoklonális 1K-F299-22-10 antitest-oszlop készítéséhez 0,8 ml képződött immungélt alkalmazunk. 25. példa Na-acetil-eglin-C izolálása és tisztítása anhidrokimotripszin-oszlop segítségével a) Polipeptidoldat előállítása az anhidrokimotripszin-osziophoz 150 ml táplevest (amit a 22. példa szerint kaptunk) 4 *C-ra hűtünk és a sejteket centrifugálással (5000 f/p, 15 perc, Sorvall RC 3B) elválasztjuk. A tiszta felülúszó. nem tartalmaz eglin-C-aktívitást Ezt követően a sejteket 12 ml oldópuffeiben [50 mM Tris*HCl (pH 8),. 30 mM NaCl] szuszpendáljuk. Ehhez az elegyhez 15 mg lizozimot (Boehringer) adunk és 30 percen át: 4 °C-on tartjuk. Ezt követően a sejteket négyszer folyékony nitrogénben való lefagyasztással és ezt követő felengedéssel 37 ‘C-ra elroncsoljuk. Utána 30 percen át 16 000 f/p-en 4 *C-on centrifugáljuk. Az N°-acetil-eglin-C aktivitást a felülúszó tartalmazza. A felülúszóban (15 ml) 7,7 g szilárd ammónium-szulfátot oldunk. A zavaros elegyet 4 ‘C-on 30 percig állni hagyjuk és utána centrifugáljuk (ld. fent). A nedves üledéket 1 ml 0,05 mM Tris»HCl-ben (pH 8) oldjuk és a kívánt polipeptidoldatot kapjuk. b) bP-acetil-eglin-C tisztítása anhidrokimotripszin(AnCht)-osz!opon Az AnCht-oszlopot (ágytérfogat 4 ml) 0,05 M Tris*HCl-lel (pH 8) egyensúlyba hozzuk. A fenti polipeptidoldatot 2,5 ml-es adagokban 4 ‘C-on visszük fel a 7 ml/óra átfolyási sebességű oszlopra. Utána 25 ml 0,05 M Tris*HCl-lel (pH 8) mossuk. Az első frakciók tartalmazzák a nem adszorbeált polipeptideket, amelyeket eldobunk. Ezt követően az oszlopot 10 ml, 0,05 M Tris*HCl-ben (pH 8) oldott 5 M nátrium-tiocianáttal (Merck) mossuk és a kapott frakciókat a HLE-teszttel (1) Na-acetil-eglin-C aktivitásra vizsgáljuk. A polipeptideket tartalmazó frakciókat ODzao-méréssel határozzuk meg. A 30. és 31. frakció tartalmaz N°-acetíl-eglin- C aktivitást, ezeket -20 *C-on vagy a további feldolgozásig jeges fürdőben tartjuk. Az Na-acetil-eglin-C aktivitás a 30. frakcióban 30 |ig/ml és a 31. frakcióban 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 31
