203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 alkalmazzuk. Kb. 6000 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk. e) Az F/(Cj-Fí-DNS-t tartalmazó kolóniák „screen"-elése A transzformált kolóniákat [18. d) példa] a 15. e) példában leírt módon megvizsgáljuk az Fi(C)-F2-DNS előfordulására. 7 pozitív kolóniát kapunk, amelyek a pML147-pML153 jelzést kapják. A pML141 (C’)t ill. pML141 (C”) plazmidokból előállított F,(C)-F2-DNS/EcoRl/BamHK ill. F,(C")Fí/EcoRI/BamHI/DNS-t analóg módon pHRil48/Eco- RI/BamHI vektorral kapcsoljuk össze. Ily módon az eglin-C’-gént [F,(C’)-F2-DNS], ill. eglin-C”-gént [Fi(C”)-F2-DNS] tartalmazó plazmidok képződnek. A plazmidokat kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjára alkalmazzuk. A transzformált sejtek tenyésztése 940, ill. 1080 ampicillin-rezisztens kolóniát eredményez. A kolóniákat 91/37 komplementer (C) oligonukleotiddal vizsgáljuk Fi(C’)-DNS, ill. Fi(C”)Fj-DNS előfordulására. 9 Fi(C’)- F2-DNS-t (eglin-C’gén) tartalmazó kolóniát és 17 Fi(C”)-F2-DNS-t (eglin- C”-gén) tartalmazó kolóniát azonosítunk. Mindegyik esetben kiválasztunk egy kolóniát és ezek a pML147 (C’), ül. pML147 (C”) jelölést kapják. 19. példa A pML199 expressziás plazmid előállítása a) Az F,(B)-F2IEcoRIIBamHIIDNS előállítása A 18. b) példával analóg módon 5 pg pML160 plazmid- DNS-t EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztünk. Az Fi(B)-Fí/EcoR]/BamHI/DNS-t a leírt módon gélelektroiforézissel választjuk el. b) A pHRH48IEcoRllBamHI vektor-DNS összekapcsolása az FiíBl-FJEcoRUBamHUDNS-sel és rekombináns plazmidok előállítása 100 pg pHRi 148/EcoRI/BamHI plazmid-DNS-t [vö. 18. a) D. példa] 28 pg Fi(B)-F2/EcoRI/BamHI/DNS-sel kapcsolunk össze a 18. c) példa szerint A rekombináns plazmidokat tartalmazó oldatot kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjára alkalmazzuk. A transzformált kolóniákat a 15. e) példában leírt módon megvizsgáljuk Fi(B)-F2- DNS előfordulására. 6 pozitív kolóniát kapunk, amelyek a pML199-204 jelzést kapják. 20. példa A pMLl47 és pML199 kiónok jellemzése A pML147 és pML199 rekombináns plazmidokban az Fi(C)- F2-, ill. Fi(B)-F2-DNS-szekvenciák karakterizálása az Fi(C)-F2-, ül. Fi(B)- F2-DNS Maxam és Gübert (3) szerinti szekvenálásával történik a 17. példában leírt módon. 10 pg plazmid-DNS-t vizsgálunk. Az Fi(C)-F2-DNS nukleotidszekvenciája a szintetikus eglin-C-génre leírttal, az Fi(B)-F2-DNS pedig a szintetikus eglin-B-génre leírttal azonos. 21. példa Eglinaktivitású polipeptidek szintézise olyan E.coli sejtekkel, amelyek rekombináns eglingéneket tartalmazó plazmidokat tartalmaznak a) Eglin-C-aktivitású polipeptidek szintézise A rekombináns eglin-C-gént tartalmazó 7 klón mindegyikét, éspedig E.coli HB 101 pML147 E.coli HB101 pML148 E.coli HB101 pML149 E.coli HB101 pML150 E.coli HB 101 pML151 E.coli HB 101 pML152 E.coli HB 101 pML153 E.coliHBlQl pML147 (C) £.co//HB101pML147(C”) megvizsgáljuk eglin-C-aktivitás kéződés szempontjából. Ebből a célból a fenti kiónokat 5 ml L-táptalajban egy éjszakán át (16 óra) 37 'C-on és 250 f/p-en tenyésztjük. Az L-táptalaj összetétele a következő: Bacto Tryptone 10 g Bacto élesztőkivonat 5g NaCl 5g glükóz 5g ampicillin 0,1 g A16 órás kultúrából 1 ml-t a következő napon 25 ml M9-közegbe viszünk át. Az M9-közeg összetétele a következő: Na2HPO<*7H20 13,25 g KHjPO* 3,0 g NaCI 0,5 g NH4CI 1,0 g CaCl2*2H20 0,015 g MgS04*7H20 0,25 g kazein-hidrolizátum 2,5 g Bi-vitamin 0,0099 g glükóz 5,0 g ampicillin 0,1 g A tenyésztést 37 'C-on és 250 f/p-en addig folytatjuk, amíg a baktériumszuszpenzió kb. 0,9-1,0 optikai sűrűséget (ODm) el nem ér. Utána a sejteket összegyűjtjük (a szaporítókultúra 5 ml-e) és a baktériumokat 0,5 ml 50 mM Tris«HCl (pH 8) és 30 mM NaCl összetételű oldatban újraszuszpendáljuk. Utána a szuszpenziót 1 mg/ml lizozim-koncentráciőjúra (Boehringer) állítjuk és 30 percre jég közé tesszük. A szuszpenzió folyékony nitrogénben történő váltakozó lefagyasztásával és 37 cC-ra való felengedésével a baktériumokat szétroncsoljuk. Ezt a műveletet ötször ismételjük, utána az elegyet 30 percen át 16 000 f/p-en 4 'C-on centrifugáljuk. A felülúszót megvizsgáljuk eglin-C- aktivitásra oly módon, hogy a humán leukocita-elasztáz (1) gátlását mérjük. A következő aktivitásértékeket kapjuk: Baktériumkivonat Eglin-C-aktivitás |ig/ml kultúra E.coli HB101 pML147 3,3 E.coli HB101 pML148 3,3 E.coli HB101 pML149 3,4 E.coli HB101 pML150 3,3 E.coli HB101 pML151 3,3 E.coli HB101 pML152 3,5 E.coli HB101 pML153 3,3 E.coli HB101 pML147 (C’) 3,0 E.coli HB101 pML147 (C”) 3,1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 29
