203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 37 'C-on 16-18 órán át állni hagyjuk. A transzformált E.coli HB101 470 ampicillin-rezisztens kolóniáját kapjuk. e) Az Fi(C)-DNS-t tartalmazó kolóniák „screen” -elése 470 transzformált kolóniát [11. d) példa] B 85 nitrocellulóz-szűrőre (Schleicher und Schüll) nyomatunk Grunstein és Hogness (24) szerint a kolóniákat oldjuk és denaturált DNS-üket rögzítjük a szúrón. Utána a szúrót 20 ml (szúrónként) 4*SET [-30 mM Tris*HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA oldata], 0,1% (g/tf) Ficoll 400 (Pharmacia), 0,5% SDS, 50 pg/ml denaturált borjútimusz-DNS összetételű oldatban 4 órán át 64 'C-on előhibridizáljuk. Ezután a nitrocellulóz-szűrőt 20 ml (szúrónként) 5*SET (g/tf) Ficoll 400, 0,2% SDS és 50 pg/ml denaturált borjutimusz-DNS összetételű oldatban 16 órán át 64 'C-on 32P-radioaktív jelzett mintával (kb. ÍOMO* Cserenkov beütés szúrónként) kezeljük. Mintaként a 91/37 komplementer (C) oligonukleotidot (vö. 6. példa) alkalmazzuk. Ezt követően a szűrőt 2«SET, 0,2% SDS összetételű oldatban szobahőmérsékleten kétszer mossuk, majd kétszer 2*SET, 0,5% SDS összetételben 60 'C-on (először 30 percig, majd 60 percig). Utána a szúrót 3 MM papír (Whatman) között szárítjuk és -80 'C-on erősítőfóliás (Intensifying screen) röntgenfilmre (Fuji) helyezzük 1-2 napra. A kapott autoradiogramm 71 pozitív kolóniát (kiónok) mutat, amelyek a további munkához alkalmazhatók, ezek közül az egyik kapja a pML87 jelölést. Analóg módon a kémiailag szintetizált Fi(C’)-DNS- t, ill. Fi(C”)-DNS-t (vö. 9. példa) EcoRI-gyel emésztjük és a linearizált pBR322/EcoRI/BalI plazmidot összekapcsoljuk, mimellett az Fi(C)-DNS-t tartalmazó pML87 (C’) plazmid, ill. az Fi(C”)-DNS-t tartalmazó pML87 (C”) plazmid képződik. E.coli HB101 sejteket pML87 (C), ill. pML87 (C”) plazmiddal transzformálunk és ampicillin tartalmú agarlemezeken tenyésztünk. 95, ill. 120 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk. A transzformált kolóniák 91/37 komplementer (C) oligonukleotiddal történő „screenelése” 37 Fi(C’)-DNS-t tartalmazó kolónia, ill. 58 Fi(C”)-DNS-t tartalmazó kolónia azonosítását eredményezi. 12. példa Az eglin-B-gén F\(B)-DNS-ét tartalmazó pML90 plazmid előállítása A 11. b) példában leírttal analóg módon 16 pg kémiailag szintetizált Fi(B)-DNS-t 5 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztünk és linearizált pBR322/EcoRI/BalI vektorral keverünk. Az enzimet inaktiváljuk és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A DNS- csapadékot a 11. c) példa szerint T4 DNS-ligázzal kezeljük, mimellett Fi(B)-DNS-t tartalmazó plazmid képződik. Arekombináns plazmidot tartalmazó oldatot a 11. d) példának megfelelően kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációjára alkalmazzuk. A transzformált E.coli HB101 310 ampicillin-rezisztens kolóniáját kapjuk. A 310 kolóniát a 11. e) példával megegyező módon megvizsgáljuk az Fi(B)-DNS előfordulására, mimellett próbaként 91/37 komplementer (B) oligonukleotidot alkalmazunk. A kapott autoradiogrammon 55 pozitív, további munkához alkalmazható klón ismerhető fel. Egyikük kapja a pML90 jelölést. 13. példa Az Fi-DNS-t tartalmazó pML136 plazmid előállítása (3. ábra) a) A linearizált pBR322IBamHfíNrul vektor előállítása 15 pg pBR322 plazmid-DNS-t 30 egység BamHI restrikciós endonukleázzal 30 percen át 37 °C-on 100 mM NaCl, 6 mM Tris*HCl (pH 7,9) mM MgCl2 és 100 pg/ml zselatin összetételű oldatban emésztünk. Utána az oldathoz 15 egység Nrul restrikciós endonukleázt adunk és 2 órán át 37 'C-on emésztjük. A reakcióelegyet 10 percre 70 'C-ra melegítjük, hogy az enzim inaktiválódjon. Utána a két DNS-fragmentet 1%-os alacsony olvadáspontú agrózon Tris-acetát-EDTA-pufferben (pH 8) végzett gélelektroforézissel elválasztjuk egymástól. Az agarőzgélben a DNS EtBr-os festése után a gélből kivágjuk a pBR322/BamHI/NruI vektor (-3766 bázispár) DNS-sávjának megfelelő helyet és 65 'C-on 10 percen át elfolyósítjuk. Ezután az elfolyósított agarózgéldarabhoz 2 térfogat 100 mM Tris*HCl-t (pH 8,7) adunk és az elegyet lehűtjük 37 'C-ra. Ezt a DNS-keveréket 0,5 egység borjúbél alkálikus foszfatázzal (Boehringer) emésztjük 30 percen át 37 'C-on. Az oldat 60 percen át 65 'C-ra való hevítésével az enzimet inaktiváljuk. Ehhez a foszfatázzal kezelt DNS-oldathoz 20 térfogat TNE-t adunk és a DNS-t Mueller et al. (23) szerint DE-52 kromatográfiával tisztítjuk, fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t -20 'C-on egy éjszakán át alkohollal kicsapjuk. A DNS- csapadékot 50 pl 0,01 M Tris*HCl (pH 8) 0,1 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk és a felhasználásig -20 'C-on tartjuk. 14 pg (-2,4 pmól vég) DNS-t kapunk. b) Az Fi-DNSIBamHI előállítása 1,6 pg (-90 pmól vég) kémiailag szintetizált F2- DNS-t (8. példa) 16 egység BamHI restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 20 pl 150 mM NaCl, 6 mM Tris*HCl (pH 7,9), 6 mM MgClj és 100 pg/ml zselatin összetételű oldatban 30 percen át 37 'C-on emésztünk. Utána az oldathoz 60 ng (-96 mmól vég) linearizált pBR322/BamHI/NruI vektort [13. a) példa] adunk, az egész oldatot TNE-re állítjuk, fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat alkohollal kicsapjuk. A kicsapott DNS-t további feldolgozásig -20 'C-on alkohol alatt tároljuk. c) A pBR322IBamHIINruI vektor-DNS kapcsolása az F2-DNSIBamHI-gyel és a pML136 plazmid megszerkesztése A 13. b) példában kapott DNS-csapadékot, amely mindkét említett DNS-firagmentet tartalmazza, 20 pl 50 mM Tris*HCl (pH 7,8), 10 mM MgCh, 10 mM DTT, 04 mM ATP, 100 pg/ml zselatin összetételű oldatban oldjuk és 15 egység/pl T* DNS-ligázzal (Biolabs) kezeljük 15 'C-on 3 órán át. Ily módon az oldat-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 24
