203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 ban az F2-DNS-t tartalmazó rekombinált pML136 plazmid képződik. d) E.coli transzformációja a pML136 plazmiddal A kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációja a 11. d) példában leírt módon történik. 10 pl 13. c) példában kapott reakcióelegyet alkalmazunk. 65 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk. e) AzF2-DNS-t tartalmazó kolóniák „screen” -elése 65 transzformált kolóniát [13. d) példa] a 11. e) példában leírt módon megvizsgálunk F2-DNS-re. Radioaktív próbaként 172/61 komplementer oligonukleotidot (vö. 5. példa) alkalmazunk. Az autoradiogrammon két pozitív kolóniát kapunk, egyikük a pML136 jelölést kapja. 14. példa A pML87, pML90 és pML136 klánok karakterizálása A rekombinált pML87, pML90 és pML136 plazmidok DNS-eit Ish- Horowitz szerint izoláljuk (25). A beillesztett F^Q-DNS, Fi(B)-DNS és F2-DNS nukleotidszekvenciáját Maxam és Gilbert eljárásával határozzuk meg (3). Ebből a célból 10-10 pg pML87 és pML90 plazmid-DNS-t EcoRI restrikciós endonukleázzal és 10 pg pML90 plazmid-DNS-t BamHI restrikciós endonukleázzal hasítunk és a linearizált DNS-eket agarőzgélből gélelúcióval izoláljuk [vö. 11. a), ill. 13. a) példák]. Utána az izolált DNS-eket alkalikus foszfatázzal emésztjük és DE-52 kromatográfiával tisztítjuk [vö. 13. a) példa]. Ezután a DNS- eket az 5’-végen [y-32P]ATP-vel (fajlagos aktivitás>5000 Ci/mmól, Amersham) és T«-polinukleotid-kin ázzál (P-L-Biochemicals) radioaktívan jelöljük. A radioaktívan jelölt DNS-eket ezután egy második restrikciós endonukleázzal (PvuII) hasítjuk. A képződött DNS-fragmenteket agarózból gélelúcióval izoláljuk. A pML87 és pML90 esetében a PvuII- EcoRI' ffagmentből (kb. 2190 bázispár) az Fi(C)-, ill. Fi(B)-DNS nukleotidszekvenciáját, a pML136 esetében az F2-DNS szekvenciáját a PvuIIB amHPfiragmentben (kb. 1815 bázispár) határozzuk meg. (+a radioaktívan jelzett DNS-véget adja meg). Az Fi(C)-DNS-re, F,(B)-DNS-re és F2-DNS-re meghatározott nukleotidszekvenciák azonosak a 8-10. példákban leírtakkal. 15. példa Az F\(C)-Fi-DNS-t tartalmazó plazmid előállítása (4. ábra) a) A linearizált pBR322IEcoRIIBamHI vektor előállítása 10 pg pBR322 plazmid-DNS-t 10-10 egység EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 100 pl 50 mM Tris«HCl (pH 7,5), 50 mM Tris*HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2 és 100 pg/ml zselatin összetételd oldatban 1 órán át 37 'C-on emésztünk. Utána az oldatot TNE-re állítjuk, 1 térfogat fenollal és kloroformmal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat alkohollal -20 'C-on egy éjszakán át kicsapjuk. A pBR322-DNS-ből kimetszett vektort (pBR322/EcoRI/BalI, 3986 bázispár) sűrűséggradiens -centrifugálással - szaharóz (5-23%) 50 mM Tris*HClben és 1 mM EDTA - választjuk el a kisebb DNS- fragmentektől (376 bázispár). A centrifugálást 30 000 f/p-en TST 41 rotorban (Kontron AG) 15 *C-on 15 órán át végeztük. Utána a lecentrifugált oldatból ISCO-gradiens-gyűjtővel 0 ,2 ml-es frakciókat szedünk. A nagy DNS-fragmentet (2916 bázispár) tartalmazó frakciókat egyesítjük és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A csapadékot 100 pl 50 mM Tris*HCl-ben (pH 8) 0,3 egység borjúbél alkalikus foszfatázzal (Boehringer) 30 percen át 37 *C-on emésztjük. Az oldatot 1 órán át 65 *C-ra melegítve az enzimet inaktiváljuk. Ezután az oldatot fenol/kloroform eleggyel extraháljuk és a DNS-t egy éjszakán át -20 *C-on alkohollal kicsapjuk. A csapadékot 50 pl 10 mM Tris*HCl (pH 8), 0,1 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk és klónozó vektorként való alkalmazásáig -20 *C-on tartjuk. 3,75 pg DNS-t (-5,7 pmól vég) kapunk. b) Az Fi(C)-DNS/EcoRI/HpaII és az Fz-DNSIBam- HIlHpalI előállítása I. Az Fi(C)-DNSIEcoRIIHpaII előállítása 10 pg pML87 plazmid-DNS-t először 100 pl 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 6 mM KC1,10 mM MgCU, 1 mM DTT és 100 pg/ml zselatin összetételű oldatban 20 egység Hpall restrikciós endonukleázzal emésztünk. Ezt követi az oldat fenol/kloroformos extrakciója és a képződött DNS-fragmentek kicsapása alkohollal -20 'C-on. A DNS-fragmentek keverékét utána 6%-os poliakrilamidgélen Tris-acetát-EDTA-pufferben (pH 8) végzett elektroforézissel szétválasztjuk. A legnagyobb DNS- fragmentet (-586 bázispár) gélelúcióval izoláljuk és ezt követően EcoRI restrikciós endonukleázzal hasítjuk [vö. 11. a), példa]. A képződött DNS-fragmentek keverékét 8%-os poliakrilamidgélen még egyszer elektroforetizáljuk. Ebből 40 ng F((C)-DNS/Eco- RI/Hpaü-t (127 bázispár) izolálunk. II. Az Fi-DNS/BamHIIHpall előállítása 20 pg pML136 plazmid-DNS-t 20 egység BamHI restrikciós endonukleázzal hasítunk. Ennek a linearizált plazmid- DNS/BamHI-nek egy alikvotját (1 pg) agarőzgélből gélelúcióval izoláljuk [vö. 13. a) példa] és [y- 32P]ATP-vel radioaktívan jelöljük (vö. 14. példa). A plazmid-DNS/BamHI főtőmegét utána ezzel a radioaktív jelölt DNS-sel keverjük. PvuII restrikciós endonukleázzal emésztjük és a PvuII-BamHI' DNS-fragmentet (1203 bázispár) 1% agarózon gélelektroforézissel izoláljuk. 14 pg PvuII-BamHI' fragmentet Hpall restrikciós endonukleázzal emésztünk (lásd fent), majd a DNS-keveréket 8% poliakrilamid- gélelektroforézissel szétválasztjuk és 150 ng F2-DNS/BamHT/HpaII-t (109 bázispár) gélelúcióval izolálunk. c) Az Fi(C)-DNS összekapcsolása az Fi-DNS-sel és a pML141 plazmid megszerkesztése 10 ng (-473 nmól vég) F,(C)-DNS/EcoRl/HpaII-t és 9 ng (-495 nmól vég) F2-DNS/BamHI/HpaII-t 20 pl térfogatban T< DNS-ligázzal kezelünk a 13. c) példában már leírt módon. Ezt kővetően az elegyet fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A DNS-csapadékot ezután a 13. a) példában 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 25
