203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATrACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC Fi(C’) CTGGAATTCATGCTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC F.(C”) 10. példa A duplex I összekapcsolása a duplex II (B)-vel, az eglin-B-gén Fi(B) fragmentjének előállítása A 9. példában leírttal megegyező módon 60-60 15 pmól duplex I-et és duplex II (B)-t kapcsolunk egymással. Az eglin-(B)-gén Fi(B) fragmentjének szerkezete a következő: CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACrGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTCATTTCCTGCCGG CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCC 11. példa Az eglin-C-gén Fi(C) fragmentjét (2. ábra) tartalmazó pML 87 plazmid előállítása a) A linearizált pBR322IEcoRIIBall vektor előállítása 30 pg pBR322 plazmid-DNS-t 5 egység Ball restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 100 pg/ml zselatint tartalmazó oldat 200 pl-ében 5 órán át 37 °C-on emésztünk. Utána az oldatot 100 mM Tris-HCl-re (pH 7,5), 50 mM NaCl-ra beállítjuk és a DNS-t 30 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 2 órán át 37 ’C-on emésztjük. Ezután az oldatot TNE-re állítjuk, 1 térfogat fenollal és kloroformmal extraháljuk és a megemésztett DNS-t 2 térfogat alkohollal -20 ’C- on egy éjszakán át kicsapjuk. A pBR322 DNS-ből kimetszett vektort (pBR322/EcoRI/BalI, 2916 bázispár) sűrűséggradienscentrifugálással - szaharóz (5-23%) 50 mM Tris-HClben (pH 8) és 1 mM EDTA - választjuk el a kis DNS- fragmentektől (1445 bázispár). A centrifugálást 36 000 f/p-en TST 41 rotorban (Kontron AG) 15 ‘C-on 16 órán át végezzük. Utána a lecentrifugált oldatból ISCO-gradiens-gyűjtővel 0,2 ml-es frakciókat szedünk. A nagy DNS-fragmentet (2916 bázispár) tartalmazó frakciókat egyesítjük és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A csapadékot 100 pl 10 mM Tris-HCl (pH 8), 0,1 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk és klónozó vektorként való alkalmazásáig -20 ’C-on tartjuk, 5,1 pg (-10,5 pmól vég) DNS-t kapunk. b) Az F,(C)-DNS/EcoRI előállítása 16 ng (-0,84 pmól vég) kémiailag szintetizált Fi(C)DNS-t (lásd 9. példa) 5 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 50 pl 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) 50 mM NaCl és 100 pg/ml zselatin összetételű pufferben 1 órán át 37 ’C-on emésztünk. Utána az oldathoz 0,5 pg (-1 pmól vég) linearizált pBR322/EcoRI/BalI vektort (lásd 11,: példa) adunk. Ezt követően az enzimet 65 ’C-on való 10 perces hevítéssel inaktiváljuk, az oldatot TNE-re állítjuk és fenol/kloroformmal extraháljuk. A DNS-t alkohollal csapjuk ki. A kicsapott DNS-t alkohol alatt -20 °C-on további feldolgozásig tároljuk. c) A pBR322/EcoRI/BalI vektor-DNS kapcsolása az Fi(C)-DNS/EcoRI-gyel és a pML87 plazmid megszerkesztése A 11. b) példában kapott DNS-csapadékot, amely a két említett DNS-fragmentet tartalmazza, 30 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 pg/ml zselatin összetételű oldatban oldjuk és 25 egység/pl T* DNS-ligázzal (Biolabs) kezeljük 15 ‘C-on 16 órán át. Ily módon az oldatban Fi(C)DNS-t tartalmazó pML87 rekombináns plazmid képződik. d) Az E.coli HB101 transzformációja a pML87 plazmiddal A transzformációhoz szükséges kalciummal előkezelt E.coli HB101 sejteket Mandel és munkatársai (6) által leírt módon állítjuk elő. A c) pont szerint kapott oldatot, amely a rekombináns pML87 plazmidot tartalmazza, 10 percen át 65 *C-on melegítettük, hogy a T4 DNS-ligázt inaktiváljuk, majd 37 ’C-ra lehűtöttük. Ebből a reakcióelegyből 10 pl-t adunk 150 pl kalciummal kezelt E.coli HB101 sejthez 10 mM MgClj és 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) összetételű oldatban, 200 pl össztérfogatban. Utána az elegyet 30 percen keresztül jégben hűtjük, 2 percre 42 ’C-ra melegítjük és utána 50 percen át 1 ml L-közegben (vő. 21. példa) 37 ’C-on állni hagyjuk. Ezután az elegyet 0,2 ml-es alikvotokban 5 agarlemezre (McConkey-Agar, Difco) kenjük, amelyek 60 pl/ml ampicillint (Serva) tartalmaznak. Az agarlapokat utána 30 35 40 45 50 55 60 23
