203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására

1

HU 203 784 B

2

belül 12 “C-ra lehűtjük. 4 pl Endo-R puffer (0,1 M Tris.HCl (pH 7,5), 66 mM MgCU, 66 mM ß-merkaptoetanol, 0,6 M NaCl) hozzáadás után 10 pl dezoxinukleozid-trifoszfát eleggyel (dATP, dCTP, dGTP, TTP egyenként 2*10'3 mólos, ammóniával pH 7-re beállított) és 2 pl (10 egység) DhB|>olimeráz I, Klenowfragmenttel (Boehringer) 30 percen át 12 'C-on inkubáljuk. A reakciót 3 perces 90 'C-ra való melegítéssel állítjuk le és az elegyet további feldolgozásig -80 'C-on tartjuk.

Az 1/40 és 30/37, 67/34 és 91/37 (C) és 67/34 és 5 91/37 (B) fragmenteket analóg módon polimerizáljuk duplex I, II (C)-vé, ill. ü (B)-vé. A duplex I—IH szerkezete a következő:

Duplex I

CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT

GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

Duplex II (C)

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG

CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC

Duplex II (B)

GACCAGGCTCGTGAATACTrCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTCATTTCCrGCCGG

CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTCAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCC

Duplex HI (F2 Eglin -C és Eglin -B)

CCGGAAGGTTCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGTAC

ggccttccaagaggacaatgagacctggacgcaatgttggcacaagcacaaaagatgttgggtccatg

TAACGTTGTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG

ATTGCAACAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC

Az 1/40 (A 12) (C) és 30/37 fragmenteket, valamint módon polimerizáljuk duplex I (C’)-sé és I (C”)-sé.

az 1/40 (A 18) (C”) és 30/37 fragmenteket azonos 30 A duplex I (C’) és I (C”) szerkezete a következő:

Duplex I (C’)

CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT

GACCTTAAGTACAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

Duplex I (C”)

CTGGAATTCATGCTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT

GACCTTAAGTACGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

9. példa

A duplex I összekapcsolása a duplex II (C)-vel, az eglin-C-gén F\( C)fragmentjének előállítása 60-60 pmól duplex I-et és duplex II (C)-t (vö. 8. példa: csak az A és G 5’-végeken kinázzal kezelt) 54 pl ligáz-pufferben [66 mM Tris*HCl (pH 1$), 6,6 mM MgCh, 10 mM ditiotreitol, 5 mM ATP] oldunk, 6 pl (-6 egység) T« DNS-ligázzal (Boehringer) elegyítünk és 21 órán át 20 'C-on inkubálunk. A reakciót 5 perces

70 °C-ra való hevítéssel leállítjuk és a DNS-t fenol/kloroformos extrakció után etanolos kicsapással izoláljuk.

Az elegy 8%-os poliakrilamid-gélen (nativ) végzett elektroforetikus elválasztása után a 122-132 bázispárt tartalmazó kapcsolási termékeket elektroeluláljuk, DE52-cellulózoszlopon koncentráljuk és eluálás után etanolos kicsapással izoláljuk.

Az eglin-C-gén Fi(C) fragmentjének szerkezete a következő:

40

45

CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCrGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT

GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCAmTGACAA

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG

CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGCACGGCC

Analóg módon kapcsolunk össze 60-60 pmól dup- Az Fi(C’) és Fi(C”) fragmentek szerkezete a követlex I (C’)-t, illetve I (C”)-t és duplex Il-t a rövidített kező: eglin-C-gén Fi(C’). ill. Fi(C”) fragmentjeivé.

60

22