203784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eglin és eglinszármazékok, és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint tesztkit eglin meghatározására
1 HU 203 784 B 2 megfelelő exo- vagy endonukleázos kezeléssel hasíthatunk le. A kettős szálú eglin-cDNS-t például úgy állíthatjuk elő, hogy alkalmas, előnyösen eglinteimelés céljából indukált piócasejtekből mRNS-t izolálunk, a kapott 5 mRNS-kevenéket önmagában ismert módon eglinmRNS-re nézve dúsítjuk, ezt a mRNS-t templátként alkalmazzuk, az egyfonalas cDNS előállításához, amelyből DNS-függő DNS-polimeráz segítségével kettős szálú cDNS-t szintetizálunk és ezt alkalmas vektor- 10 ba klónozzuk. Az eglin-cDNS-t tartalmazó kiónokat például a fent teirt módon kolónia-hibridizálással, radioaktív jelzett eglin-DNS specifikus oligodezoxinukleotid alkalmazásával azonosítjuk. A módosított eglineket kódoló DNS-szekvenciák 15 előállításához a genomból kapott eglin-DNS-t vagy az eglin-cDNS-t megfelelő exo- és endonukleázokkal kezelhetjük, amelyek az N-, ill. C-terminális aminosavakat kódoló DNS-szakaszokat lehasítják. A genomból ily módon kapott eglin-DNS-t vagy az 20 eglin-cDNS-t előnyösen az 5’- és 3’-végen, olyan kémiailag szintetizált adapter-oligodezoxinukleotidokkal kapcsoljuk össze, amelyek egy vagy több különböző restrikciós endonukleáz felismerési szekvenciáit tartalmazzá és ezáltal a megfelelő vektorokba való beépítést 25 megkönnyítik. Az eglin-DNS, ill. -cDNS 5’-végéhez kapcsolt adaptermotekulának tartalmaznia kell még a transzláció startjelét (ATG). A transzláció startjele olyan elhelyezkedésű tegyen, hogy közvetlenül az eglin első aminosavának kodonja kövesse. 30 Mivel a természetes eglingén struktúrája nem ismeretes és az eglingén kémiai szintézise a modem szintézislehetőségek alapján előnyökkel jár, utóbbi a találmány előnyös kiviteli formáját képezi. 35 5’ Met B (X)„ ATG D Pro Glu Val Val Gly Lys Thr CCX GAM GTS GTX GGX AAM ACX Ala Arg Glu Tyr Phe Thr Leu GCX LGN GAM TAY TTY ACX YTZ Gin Tyr Asp Val W Phe Leu CAM TAY GAY GTX YAY TTY YTZ Ser Pro Val Thr Leu Asp Leu QRS CCX GTX ACX YTZ GAY YTZ Arg Val Arg Val Phe Tyr Asn LGN GTX LGN GTX TTY TAY AAY Asn Val Val Asn B’ NON AAY GTX GTX AAY D’ TMK (X). Az eglingén kémiai szintézise A találmány eljárás különösen az eglin vagy módosított eglin struktúrgénjének vagy annak fragmentjeinek előállítására azzal jellemezve, hogy az eglingén vagy módosított eglingén kódoló és komplementer szálának szegmentjeit kémiailag szintetizáljuk és a kapott szakaszokat enzimetikusan az eglin vagy a módosított eglin struktúrgénjévé vagy annak fragmentjeivé alakítjuk. A találmány továbbá olyan kettős szálú DNS-ekie vonatkozik, amelyek az eglineket, például az eglin-B-t vagy eglin-C-t, módosított eglineket, például módosított eglin-B-t vagy módosított eglin-C-t, vagy azok fragmentjeit kódolják. A találmány szerinti DNS-ek az eglinek, ill. módosított eglinek kodonjain kívül tartalmazzák a transzláció start- és stopjeleit - amik alkalmas gazdasejtben például E.coliban tehetővé teszik az expressziót - továbbá a végeken olyan nukleotidszekvenciákat, amelyek vektorba történő beépítésre alkalmasak. A találmány egyik előnyös kiviteli formája olyan DNS-re vonatkozik, amelyben az 5’-végen tevő, restrikciós enzimmel hasítható nukleotidszekvenciát a transzláció startjele, az eglin vagy a módosított eglin kodonjai - amelyek adott esetben egy vagy több helyen tehetővé teszik a restrikciós enzimmel történő hasítást - a transzláció stopjele és a 3’-végen egy restrikciós enzimmel hasítható nukleotidszekvencia követik. A találmány szerint alkalmazható restrikciós enzimek például az EcoRI, Bam- HI, Hpall, Pstl, Aval vagy Hindin. A találmány eljárás, különösen olyan eglint kódoló (I) általános képletű nukleotidszekvenciából és a komplementer nukleotidszekvenciából álló, kettős szálú DNS Val Asp Gin GTX GAY CAM His Tyr Pro CAY TAY CCX Pro Glu Gly CCX GAM GGX Arg Tyr Asn LGN TAY AAY Pro Gly Thr CCX GGX ACX 3’ ahol a képletben a nukleotidszekvenciát az 5’-végtől kezdődően tüntettük fel és jobb megértés kedvéért megadtuk a tripletek által kódolt aminosavakat, és ahol D jelentése egyes kötés vagy az eglin N-terminális 60 aminosavát kódoló nukleotidszekvencia és B jelentése egyes kötés vagy az alábbi csoportból választott megfelelő N-terminális aminosavak, 3
