203782. lajstromszámú szabadalom • Eljárás koleszterin-oxidáz enzim előállítására
1 HU 203 782 B 2 A találmány tárgya új eljárás koleszterin-oxidáz-enzim előállítására mikrobiológiai (fermentációs) úton. Ismert, hogy a koleszterin lebontására képes mikroorganizmusok koleszterin-oxidáz-enzimet termelnek, amit a diagnosztikában elsősorban testnedvek (így vérszérum, plazma) koleszterintartalmának meghatározására alkalmaznak. Koleszterin-oxidáz-enzim termelésére alkalmas mikroorganizmusok például az Arthrobacter simplex, Brevibacterium sterolicum, Corynebacterium cholesterolicum, Mycobacterium rhodochous, Nocardia cholesterulicum, Nocardia erythropolis, Nocardia formica, Pseudomonas fluoresce ns, Schizophyllum commune, Streptomyces lavendulae és Streptomyces violascens [J. Steroid Biochem. 7, 705- 713 (1976); Clin. Chim. Acta 73, 487-496 (1976); J. Ferment. Technoi. 60, 31-35 (1982)]. Eddig már igen sokféle eljárást kidolgoztak koleszterin-oxidáz mikrobiológiai előállítására. Az ismert eljárások elsősorban az enzimtermelő mikroorganizmus tekintetében különböznek egymástól. A 2 224 131, 2 224 133,2 264 646,2 305 232,2 307 518 és 2 456 586 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat Nocardia erythropolis, míg a 4 093 517 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és a 2 650 753 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat Nocardia cholesterolicum használatát ismerteti. A 2 246 695 és 2 656 063 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat szerint az enzim termelésére más Nocardia fajok is alkalmasak. A 2 557 499 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat Schizophyllum commune, a 81 878 sz. európai közzétételi irat Arthrobacter sp., míg a 4 093 517 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás különféle Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia és Streptomyces fajok felhasználásáról számol be. Az idézett közleményekben ismertetett megoldások közös jellemzője, hogy a koleszterin-oxidáz-enzim sejten belül (intracellulárisan) képződik 1-5 napos fermentációs idő alatt 50-800 nemzetközi egység/liter mennyiségben (1 nemzetközi egység (NE) az az enzimmennyiség, amely 37 “C-on 1 perc alatt 7,0 pH-értéken 1 pmól koleszterint bont le 4-koleszten-3-on keletkezése közben). Sejten belüli enzimtermelés esetén a fermentlé feldolgozásának kezdő lépése a sejtfeltárás, és csak ezt követően lehet a sejtekből a felszabadult enzimet elkülöníteni a fermentlé folyadékfázisából. Miként az idézett közleményekből megállapítható, a sejtfeltáráshoz általában mechanikus, ultrahangos, fagyasztásos vagy felületaktív anyagokat alkalmazó sejtroncsolási módszereket használnak. Valamennyi sejtfeltárási módszer közös jellemzője, hogy nehézkesek, rendkívül idő- és energiaigényesek, ugyanakkor jelentős aktivitásveszteséggel is kell számolni, mert a sejtfeltárási folyamatok a termelt enzimet is károsítják. A felületaktív anyagot alkalmazó sejtfeltárási módszerek további hátránya, hogy a terméket szennyező felületaktív anyagot további tisztítási műveletekben lehet csak eltávolítani. Ezek a hátrányok olyan mikroorganizmusok alkalmazásával küszöbölhetők ki, amelyek sejten kívül (extracellulárisan) termelnek koleszterin-oxidáz-enzimet. A szakirodalomból ismert, hogy a Rhodococcus nemzetségbe tartozó egyes törzsek extracellulárisan is képesek koleszterin-oxidáz-enzimet termelni. A J. Gén. Appl. Microbiol. 32, 137-147 (1986) közlemény különböző Rhodococcus törzsek enzimtermelő-képességének vizsgálatával foglalkozik. A legnagyobb enzimtermelő-képességgel rendelkező törzs által intracellulárisan és extracellulárisan termelt koleszterin-oxidázenzim mennyisége 0,241 NE/ml; ebből mindössze 0,0152 NE/ml enzim képződik extracellulárisan. A J. Appl. Bacteriol. 61, 269-274 (1986) és J. Agric. Food Chem. 37, 1178-1182 (1989) közlemények szerint a vizsgált törzsek közül a Rhodococcus equi No. 23 (JCM 6819) törzs termelőkapacitása bizonyult a legjobbnak; ez a törzs 0,03 NE/ml koleszterin-oxidázenzimet képes extracellulárisan termelni. Ugyanezt a megállapítást tartalmazza a Rakuno Kagaku, Shokuhin no Kenkyu 34, 195-202 (1985) és 36, 287-291 (1987) közlemény [Chem. Abstr. 104R, 182 924a (1986) és 108R, 164 456c (1988)]. Megállapítható, hogy a koleszterin-oxidáz extracelluláris termelésére képes mikroorganizmusok enzimtermelő-kapacitása csekély. Célul tűztük ki olyan eljárás kidolgozását koleszterinoxidáz fermentációs előállítására, amelyben az enzim extracellulárisan termelődik, és az enzim az eddigieknél lényegesen nagyobb termelékenységgel állítható elő. Kísérleteinkben különbző talajmintákból koleszterin és ß-szitoszterin-lebont0 mikroorganizmusokat izoláltunk, és ezeket koleszterin-oxidáz-enzim sejten kívüli termelésére vizsgáltuk. Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy az általunk izolált mikroorganizmusok közül a TUB B-58 jeli mikroorganizmus - ami az azonosítási vizsgálatok szerint Rhodococcus sp.-nek [Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 2. kötet 1472. oldal (Williams and Wilkins, 1986)] bizonyult és amit a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében (Budapest) 1987. 06. 29-én NCAIM (P) B 001 003 számon helyeztünk letétbe - alkalmas a koleszterin-oxidáz-enzim sejten kívüli termelésére, és a kívánt enzimet rövid tenyésztési idő alatt nagy koncentrációban szolgáltatja. Az általunk elkülönített Rhodococcus sp. TUB B-58 jelű törzs főbb mikrobiológiai jellemzőit az alábbiakban foglaljuk össze: Megjelenés: narancssárgás-rózsaszínű, fényes, kissé folyós, kör alakú telepek Mikroszkópi kép: gömb alakú (coccus), nem mozgó, sejtátmérő < ljim Gram-festődés: + Kataláz: + Oxidáz: Anaerob növekedés: nem vagy igen gyengén növekszik Voges-Proskauer reakció: - Növekedés 20 'C-on: gyengén növekszik 30-37 'C-on: jól növekszik 45 'C-on: nem növekszik 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
