203782. lajstromszámú szabadalom • Eljárás koleszterin-oxidáz enzim előállítására
1 HU 203 782 B 2 Keményítőhidrolízis: Kazeinbontás: Nitrát redukció: + Karbamidbontás: + Savképzés dextrózból: xilózból: arabinózból: -laktózból: mannitból: Gázképzés dextrózból: Hemolízis: Növekedés pH 5,7-en: gyenge 5% NaCl: gyenge Citrátfelhasználás: Fenilalanin-dezaminálás: Tirozinbontás: -5 10 15 A találmány tárgya tehát eljárás koleszterin-oxidázenzim előállítására oly módon, hogy a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében 20 NCAIM (P) B 001 003 számon letétbe helyezett Rhodococcus sp. TUB B-58 törzset a mikroorganizmus számára asszimilálható szén- és nitrogénforrást, szervetlen sókat, felületaktív anyagot és habzásgátlót tartalmazó táptalajon levegőztetés közben, süllyesztett 25 körülmények között tenyésztjük, majd az enzimtartalmú fermentléből ismert módon elkülönítjük a koleszterin-oxidázt. A fermentációt előnyösen 20-40 *C-on, 5 és 8 közötti pH-értéken végezzük. 30 A mikroorganizmus számára asszimilálható szénforrás egy részeként előnyösen szterint (koleszterint vagy ß-szitoszterint) alkalmazunk, ami az enzim bioszintézisénél induktorszerepet is betölt. A fermentáció rövid idő alatt lezajlik, és a koleszte- 35 rin-oxidázt nagy termelékenységgel szolgáltatja. 72 órás fermentálás után a fermentlé rendszerint 2500- 3000 NE/liter koleszterin-oxidázt tartalmaz. A teljes termelt enzimmennyiség sejten kívüli, így az enzim elkülönítéséhez előzetes sejtfeltárásra nincs szükség. 40 Az enzimtartalmú fermentlé a biomasszától egyszerű centrifugálással elválasztható, és az enzim ismert módszerekkel egyszerűen elkülöníthető a fermentléből. A találmány szerinti eljárást az alábbi példában részletesebben ismertetjük. 45 Példa Rhodococcus sp. TUB B-58 liofilizált tenyészetével oltjuk be a következő összetételű táptalajt: Bouillon-por 1,2 tömeg% 50 Élesztőkivonat 0,1 tömeg% Hidrolizált kazein 0,1 tömeg% Glükóz 2,0 tömeg% Bacto agar (Oxoid C.No.L-11) 2,0tömeg% (A táptalaj pH-ja sterilizálás előtt 6,5-6,7.) 55 A beoltott táptalajt 5 napon át 28 *C-on inkubáljuk, és így a mikroorganizmust elszaporítjuk. 300 cm’-es Erlenmeyer-lombikba 50 cm’ alábbi összetételű vizes táptalajt töltünk: 60 Koleszterin 0,5 tömeg% Naprafoigódara 0,5 tömeg% Szójaliszt 1,0 tömeg% Kukoricalekvár-por 1,0 tömeg% Glükóz 0,75 tömeg% Glicerin 0,25 tömeg % Tween 80 (felületaktív anyag) 0,2 tömeg% CaC03 0,1 tömeg% MgS04*7H20 0,05 tömeg% Karbamid 0,2 tőmeg% KH2PO4 0,1 tömeg% A3 habzásgátló (Chinoin) 0,1 tömeg% (A táptalaj pH-ja sterilizálás előtt 6,0.) A táptalajt autoklávban 121 °C-on 30 percig sterilizáljuk. A steril, szobahőmérsékletre hűtött táptalajt kacsnyi tenyészettel vagy a tenyészet 10M07 sejt/cm3 koncentrációjú vizes szuszpenziójával beoltjuk, majd síkrázógépen 300 fordulat/perc rázási sebesség fenntartásával 30 *C-on 72 óráig tenyésztjük. Az enzimtartalmú fermentlevet 15 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A kapott felülúszó koleszterin-oxidáz aktivitása 2500-3000 NE/liter. A kapott oldathoz részletekben, finom por formájában az oldat telítéséhez szükséges mennyiségű ammónium-szulfátot adunk, az elegyet az ammónium-szulfát teljes mértékű feloldódásáig keverjük, majd a kapott oldatot 16 órán át 4 *C-on tároljuk. A kivált csapadékot centrifugálással elkülönítjük, 0,05 mólos Trisz-HCl pufferoldatban (pH 7,5) oldjuk, és az ammónium-szulfátos leválasztást megismételjük. A kivált csapadékot centrifugálással elkülönítjük, 0,01 mólos Trisz-HCl pufferoldatban (pH 7,0) oldjuk, és az oldatot dializáljuk. Ezután az oldathoz Whatman gyártmányú DEAE- 32 dietil-amino-etil-cellulóz anioncserélő-gyantát (C. No. 4055-200) adunk, az elegyet keverjük, majd a gyantát üvegszúrőn kiszűrjük. Az enzimet tartalmazó szűrletet liofilizáljuk. A kapott összes koleszterin-oxidáz-enzim aktivitás 1 liter fermentlére számítva 1800 NE (2 NE/mg fehérje). SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás koleszterin-oxidáz-enzim előállítására, azzal jellemezye, hogy a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében NCAIM (P) B 001 003 számon letétbe helyezett Rhodococcus sp. TUB B-58 törzset a mikroorganizmus számára asszimilálható szén- és nitrogénforrást, szervetlen sókat, felületaktív anyagot és habzásgátlót tartalmazó táptalajon levegőztetés közben, süllyesztett körülmények között tenyésztjük, majd az enzimtartalmú fermentléből ismert módon elkülönítjük a koleszterin-oxidázt. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezye, hogy a mikroorganizmus számára asszimilálható szénforrás egy részeként szterint alkalmazunk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezye, hogy a fermentációt 20-40 'C-on, 5 és 8 közötti pH-értéken végezzük. 3
