203771. lajstromszámú szabadalom • Eljárás renin-gátló dipeptid-karbamoil-származékok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 203 771 B 2 nyomáscsökkentő hatásának közvetlen oka tehát a fenti aktív peptid hormon koncentrációjának csökkentése. A reningátlók hatékonyságát in vitro vizsgálattal ellenőrizhetjük. Ennek során az angiotenzin I képződésének csökkenését különböző rendszerekben (humán plazma, tisztított humán renin) mérjük. A vizsgálat alapelve, hogy például a humán plazmát, amely mind renint, mind angiotenzinogént tartalmaz, 37 °C hőmérsékleten a vizsgálandó vegyülettel inkubáljuk. Ennek során az angiotenzinogénből a renin hatására angiotenzin I válik ki, amely a szokásos radioimmuno assay vizsgálattal mérhető. A reningátlók ezt az angiotenzin felszabadulást gátolják. A plazma előállításához önkéntes jelentkezőktől vért veszünk (mintegy 0,5 liter fejenként, Bluko-Entnahmegerät der Fa. ASID Bonz und Sons, Unterschleissheim, NSZK) és jéghűtés közben részben légtelenített üvegekben felfogjuk. A véralvadás meggátlásához 10 mmól/1 végkoncentrációban EDTA-t adagolunk, majd a mintát 3500 fordulat/perc mellett 0-4 °C közötti hőmérsékleten 15 percen keresztül centrifugáljuk (HS 4 rotor, Sorvall), amelyet kívánt esetben megismételünk, majd a plazmát pipettával óvatosan eltávolítjuk és megfelelő adagokban -30 *C hőmérsékleten fagyasztjuk. A vizsgálatokhoz csak a megfelelő renin-aktivitást mutató plazmát alkalmazzuk. Az alacsony renin-aktivitást mutató plazmát megfelelő kezeléssel (-4 °C hőmérsékleten tárolva 3 napon keresztül) aktiváljuk, amelynek során a proreninből renin képződik. A vizsgálatok megvalósításához az angiotenzin I mennyiségét Renin-Maia készlettel (Serono Diagnostics S. A., Coinsins, Svájc) határozzuk meg. A plazma inkubálását az ott megadott útmutató szerint végezzük. Az inkubáláshoz alkalmazott oldatok: 1000 pl plazma (0-4 °C hőmérsékleten felolvasztva) 100 pl foszfátpuffer (pH-7,4) (adalékanyag 10"4 mól/1 ramiprilát) 10 pl PMSF-oldat 10 pl 0,1 tömeg%-os Genapol PFIC 12 pl dimetil-szulfoxid, illetve tesztkészítmény. A tesztkészítményt 10-2 mól/1 koncentrációban 100 tömeg%-os dimetil-szulfoxidban oldjuk és dimetil-szulfoxiddal a kívánt koncentrációra hígítjuk. Az inkubáláshoz alkalmazott oldat legfeljebb 1 tömeg% dimetil-szulfoxidot tartalmazhat Az oldatokat jégen hűtve összekeverjük és egy órán keresztül vízfürdőben 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Egy további vizsgálati elegyből, amely inhibitort nem tartalmaz, inkubálás nélkül összesen hat mintát (egyenként 100 fxl) veszünk a kiinduló angiotenzin I tartalom meghatározására. A vizsgálati készítmények koncentrációját úgy választjuk meg, hogy mintegy 10-90%-os enzimgátlásnak feleljen meg (legalább öt különböző koncentráció). Az inkubálás végén minden elegyből háromszor 100 pl mintát veszünk egy előre lehűtött Eppendorf-edényben, majd száraz jégen fagyasztjuk és mintegy -25 *C hőmérsékle- \ ten tároljuk az angiotenzin I mennyiségének meghatározásáig (három mérésből számolunk átlagértéket). » Az angiotenzin I radioimmuno assay vizsgálatához pontosan betartjuk a Renin-Maia készlet előírásait. A koncentrációgörbét 0,2-25,0 ng/ml angiotenzin I koncentrációnál vesszük fel. Az alap angiotenzin I tartalmat minden mérési eredményből levonjuk. A plazma renin-aktivitást (PRA) az angiotenzin I-re vonatkoztatott ng/ml*óra mértékegységben adjuk meg. A vizsgált hatóanyag jelenlétében mért PRA-értéket inhibitor nélküli minta eredményére, mint 100%-ra vonatkoztatjuk és ez alapján százalékos maradék aktivitást adunk meg. A maradék aktivitást a vizsgált hatóanyag koncentrációjával szemben ábrázolva meghatározzuk az IC» értéket Az új (I) általános képletű vegyületek in vitro körülmények között az alábbi IC» értékeket mutatják: Hatóanyag példa száma IC» (pmól/1) 1. 2,0 ' 2. 0,62 3. 0,9 4. 0,38 5. 1,0 6. 0,4 7. 0,26 8. >10 9. 6,5 10. >1 11. 0,9 12. 5,5 13. 0,34 14. 8 29. 0,65 A reningátlók sószegény állatokban csökkentik a vérnyomást. Mivel az emberi renint megkülönböztetik a más fajoktól származó renintől, az in vivo vizsgálatokhoz főemlősök, például Rhesus-majom alkalmaz-hatók. A főemlős renin és a humán renin szekvenciájában messzemenőén homológ. Furoszemid i. v. injekció formában történő beadásával endogén renin kiválasztást váltunk ki. A vizsgált hatóanyagot folyamatos infúzió formájában adagoljuk és a vérnyomásra és a szívfrekvenciára gyakorolt hatását mérjük. Az új (I) általános képletű hatóanyagok mintegy 0,1-5 mg/kg i. V. dózisban hatékonyak gasztroszkőpon keresztül intraduodenálisan adagolva a dózishatár mintegy 1- 50 mg/kg. Az új (I) általános képletű vegyületek tehát felhasználhatók a magas vérnyomás csökkentésére és szívelégtelenség kezelésére. A találmány szerint előállított (I) általános képletű vegyületet elsősorban gyógyszerkészítmény formájában alkalmazzuk főemlősöknél, elsősorban embereknél. A gyógyszerkészítmények a hatékony mennyiségű (I) általános képletű vegyület mellett szervetlen vagy szerves gyógyászatiig alkalmazható hordozóanyagot tartalmazhatnak. Az adagolás alkalmazható intranazálisan, intravénásán, szubkután vagy orálisan. A ható5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
