203675. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alegység-vakcina előállítására a sertések Aujeszky-féle betegsége ellen
1 HU 203 675 B 2 pos kép lényegesen megváltozott, az egyedi sejtek óriássejtekké olvadtak össze és a vírushatás következtében leváltak az edények üvegf elületéről. Minthogy ekkor a vírus jelentős része a sejthez kötött, a teljes tenyészetet - 20 °C hőmérsékletre történő lefagyasztással, majd ezt követően szobahőmérsékletre való felmelegítéssel feltártuk. Az oldhatatlan sejttörmeléket az elegy bői 10 perces, 2500ford^perc sebességgel történő centrifugálással eltávolítottuk. A felűlúszóból a vírust MSE Superspeed 65 típusú ultracentrifugával, 90 perces 21000 fordVperc fordulatszámon 6 x 250 ml-es szögrotorban végzett ülepítéssel nyertük Id. Az üledékben található vírust rövid ultrahangos kezeléssel az ultracentrifugáláshoz általánosan használatos TNE trísz-nátriumklorid-etUéndiamin-tetraacetát (EDTA) puff erben reszuszpendáltuk és az oldhatatlan csapadékot 10 perces, 2500 fordVperc fordulatszámon végzett centrifugálással eltávolítottuk. Az így kapott nyers vírusszuszpenziót előzetesen megkevert szacharóz-gradiensre rétegeztük, amely szacharózra nézve 10-től 60%-ig terjedt. A gradienscentrifugálást a hivatkozott típusú ultracentrifugában 3 órán keresztül 30000 fordVperc fordulatszámmal végeztük SW 3 x 25 ml-es rotorban. Az ultracentrifugálás után egymástól elkülönítve leszívott frakciók vírustartalmát tápfolyadékkal való hígítást követően VERŐ szövettenyészetre való oltással vizsgáltuk, és a vírusfrakciót kiválasztottuk. A komplett vírust tartalmazó frakciót TNE pufferral 10 ml-re hígítottuk, majd 1 térf% végkoncentrációban oktilfenil-polietilénglikol-étert (kereskedelmi nevén Triton X100, forgalmazza: Reanal Finomvegyszergyár, Budapest) adtunk hozzá. A keveréket 30 percig 45 °C hőmérsékleten kevertük, ami a vírusenvelop felbomlását és a nukleokapszid felszabadulását eredményezte. A TRITON X100 olyan detergens, amelynek molekulái a hidrofób oktü-fenil, valamint a hidrofil polietilénglikd részekből épülnek fel. Az amfifil felépítés következtében a detergens molekulák akár önmagukban, akár más amfifil tulajdonságú molekulákkal keuerteamicellákat képeznek, így a sejtmembránból származó vírusenvelop lipid-detergens és glikoprotein-detergens micellákká esik szét. A keverékből a vírus nukleokapszidokat a hivatkozott típusú ultracentrifugában 20%-os szacharóz párnán 90perees, 45000 fordVperc sebességgel SW 6 x 5 ml-es rotorban végzett ultracentrifugálással távolítottukel.Azígy kapott felül úszóban ellenáramú immunelekCroforétíssal (Frey, H. M. et al.: J. Infect. Dis. 1981,143,274.) kimutattuk az Aujeszky-féle betegség vírusára jellemző felszíni glikoproteineket. A felülúszót vele azonos térfogatú semleges sztiroldivinil-benzol-kopolimer porózus, adszorbens gyantával (kereskedelmi nevén: Amberlite XAD-2, a Rohm and i Baa&.úó** Philadelphia, Pennsylvania terméke) $89b#$P)&£ékl6ten. 2 órán keresztül rázogattuk. A lö^áá ériedöiényekénf a folyadék opálossá változott, «Há^értdtoűenaróítzecskeméret megnövekedésére utalt. Az Amberlite kezelés a detergens eltávolítását eredményezte, ennek következtében a folyadékban maradt lipidek és glikoproteinek aggregálódtak, belőlük feltételezhetően viroszómák (nukleokapszid nélküli envelopok) alakultak ki. A kapott preparátum esetleges maradék fertőzőképességét szövettenyészetre való oltással, valamint kb. 1,5 kg testtőmegű új-zélandi nyulak izomba történt beoltásával ellenőriztük. A folyadékban egyik módszerrel sem lehetett élő vírust kimutatni. Aglikoprotein-preparátumot 50 mikrogramm/állat mennyiségben azonos térfogatú komplett Freund-adjuvánssal (DIFCO Laboratories, Detroit, Michigan) emulgeálva az Aujeszky-féle betegségtől mentes állományból származó három sertésbe izomba oltottuk. A fehérjekoncentrációt bicinkoninsavas reagenssel mértük (a reagensét BOA reagens néven a Pierce Eurochemie B. V. Hollandia cég forgalmazza). Az állatok testtömege kb. 20 kg volt. Az oltást 1 hónap elteltével hasonló glikoprotein mennyiséggel, de adjuváns nélkül megismételtük. Újabb két hét elteltével az állatoktól vért vettünk. Az alvadás után centrifugálással kapott vérsavókat 56 °C hőmérsékleten 30 percig kezeltük, majd vírussemlegesítő ellenanyag-tartalmukat állandó vírus-változó savóhígítások alkalmazásával, mikromódszerrel vizsgáltuk (Vajda G. és mtsai: Magyar Állatorvosok Lapja, 1986, 41, 543). A vizsgált vérsavók 1:1024-1:2048 hígításban semlegesítették az Aujeszky-féle betegség vírusának a szövettenyészetre gyakorolt hatását. Ez a vizsgálat igazolta, hogy a leírtak szerint előállított Aujeszky-féle betegség vírusából származó glikoprotein-koncentrátum hatékony immunogenitással rendelkezik és alegység-vakcinaként eredményesen használható. A savókat a további vizsgálatok során standard pozitív glikoprotein specifikus reagensként alkalmaztuk az eredetileg varicella-zoster vírus gyors kimutatására leírt ellenáramú immunelektroforézisos módszernek az Aujeszky-féle betegség glikoproteinjeinek kimutatására adaptált változatához (Frey, H. M. et al.: J. Infect. Dis. 1981,143,274.). 2. példa Az 1. példában leírtakhoz hasonló körülmények között szaporítottuk el az Aujeszky-féle betegség vadvírusát (szintén az 1. példában használt saját izolátumból). A szaporításhoz VERŐ sejtvonal helyett azonban a sertések szempontjából fajazonos PK-15 (sertésvese eredetű) sejtvonalon. A frakcionálatlan teljes tenyészethez 1 térf% térfogat-végkoncentrációban oktilfenil-polietilénglikol-étert (Triton X 100-at) adtunk, majd az elegyet 30 percig 45 °C hőmérsékleten kevertük. A detergens hozzáadásával az 1. példánál leírtakhoz hasonlóan a vírus envelop és a gazdasejt membránok felbomlottak és micellákká alakultak, miközben a nukleokapszid és a sejtmag kiszabadult. A keverékből a sejtmagokat, az oldhatatlan sejttörmeléket és az egyéb csapadékot 2500 ford7perc sebességgel 10 percen át végzett centrifugálással eltávolítottuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
