203675. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alegység-vakcina előállítására a sertések Aujeszky-féle betegsége ellen
1 Hü 203 675 B 2 Az elkülönített felülúszóból a vírus-nukleokapszidot az 1. példában leírtak szerint 20%-os szacharóz párnán végzett ultracentrifugálással ülepítettük ki. Eddig a szakaszig eljárásunk lényegében a Maes és Schutz által javasolt (Maes, R. K. and Schutz, J. G: Am. J. Vet. Rés. 1983,44,123.) alegység vakcina készítési módszernekfelelt meg. Aglikoproteineket tartalmazó leszívott felülúszó az 1. példában említett ellenáramú immunelektroforézises módszerrel vizsgálva 1:8 hígításban pozitív eredményt adott. A felülúszót az 1. példában leírt módon semleges sztiroldivinil-benzol-kopolimer adszorbens gyantával (kereskedelmi néven: Amberlite XAD-4, a Rohm and Haas, Philadelphia, Pennsylvania terméke) mentesítettük a detergenstől. A glikoprotein-frakció specifikus antigéntartalmát vírussemlegesítés-gátlási próbával vizsgáltuk. Az antigénpreparátumból tápfolyadékban kettes léptékű hígításokat (2,4,8,...) készítettünk. A próbában ellenanyagként az 1. példában ismertetettek szerint nyert, 1:1024 vírussemlegesítő titerű sertés vérsavó négy neutralizáló egység ellenanyagot tartalmazó 1:256-os hígítását használtuk. Az azonos térfogatban vett savó és antigén hígításokat összekeverés után 37 °C-on 1 órát inkubáltuk termosztátban, majd 10 percig2500 fordiperc fordulatszámon centrifugáltuk. Az elkülönített felülűszó maradék ellenanyagtartalmát 100 TdD50 (50%-os szövettenyészet-károsító adag) Aujeszky-féle betegség vírusa hozzáadását követő újabb 1 órás, 37 °C hőmérsékleten végzett indubálás után szövettenyészetre való oltással vizsgáltuk az 1. példában leírt mikromódszer segítségével. A vizsgált preparátum 1:4 hígításig gátolta a próbában alkalmazott ellenanyag mennyiség vírussemlegesítő hatását. Az 1. példában leírt eljárásokkal vizsgálva a készítmény maradék élővírust nem tartalmazott. Az izomba oltott nyulak vérsavója az (egyszeri) oltást követően három héttel az Aujeszky-féle betegség vírusát (az 1. példában leírt mikromódszerrel vizsgálva) 1:8-1:16 hígításban semlegesítette. 3 3. példa A Phylaxia Állatgyógyászati Oltóanyagtermelő Vállalat, Budapest által termelt, a kereskedelemben forgalmazott Aujeszky-féle betegség elleni élővírusos vakcinából származó Bartha K/61 törzset PK-15 sejttenyészetben mikrokarrieren (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala) szaporítottuk. Az így kapott törzs gl glikoproteint nem tartalmaz, miután nukleinsavából az ezt a fehérjét kódoló génszakasz hiányzik. Ennek a törzsnek a használata a gl-en alapuló differenciáldiagnosztikai módszer alkalmazására is lehetőséget teremt. A további eljárási lépések megegyeztek a 2. példában leírtakkal, és ezek eredményeként glikoprotein preparátumot kaptunk. A preparátum antigéntartalmát az 1. példában leírtak szerint termelt immunsavónak négy neutralizáló egységet tartalmazó hígításával vírusneutralizáció-gátlási próbával vizsgáltuk. A preparátum 1:8 hígításban gátolta a savó vírussemlegesítő hatását, ami igazolja a protektivitásért felelős antigéntartalmát. Az 1. példában leírtak szerint végzett maradék fertőzőképesség meghatározás negatív eredményre vezetett, az oltott nyulak vérsavója két héttel az (egyszeri) oltást követően 1:16 -1:32 titerben semlegesítette az Aujeszky-féle betegség vírusát. Ezt a tényt az 1. példában hivatkozott mikromódszerrel állapítottuk meg. 4. példa A 2. példában leírtak szerint jártunk el a detergens kezelést követő alacsony fordulatszámú centrifugálásig, és kapott, centrifugált folyadékból mintákat vettünk és ezekhez rendre az oldat végkoncentrációjára vonatkoztatott 1,2,3,4,5,6,7,8,9 és tömegszázalék 6000 dalton molekulatömegű polietilénglikolt (kereskedelmi nevén Karbowax 6000, forgalmazza a Reanal Finomvegyszergyár, Budapest) adtunk, majd az elegyeket egy éjszakán (kb. 16 órán) át +4 °C hőmérsékletű hűtőszekrényben állni hagytuk. Az állást követően a folyadékban pelyhes, fehér csapadék képződött, amelynek mennyisége a polietüénglikol mennyiségével arányosan nőtt. Ezt követően a képződött csapadékot 5000 ford ./perc fordulatszámon 10 percen át végzett centrifugálással kiülepítettük. Feltételeztük, hogy a polietilénglikol adott koncentráció felett kicsapja a vírusfehérjéket, ezen belül a protektiv glikoproteineket is. Az elkülönített felülúszó glikoprotein tartalmát az 1. és 2. példákban leírtak szerint ellenáramú immunelektroforézissel, illetve vírussemlegesítés-gátlási próbával vizsgáltuk. Amikor a polietüénglikol koncentráció 4% alatt volt, glikoprotein kicsapódást nem tapasztaltunk. Ilyen koncentrációnál azonban a csapadék jelentős mennyiségű egyéb szennyező fehérjét (nagy molekulatömegű sejt- és vírusfehérjék) tartalmazott. A glikoprotein-detergens micellák a 4% feletti polietüénglikol hatására disszociálnak, és belőlük a glikoprotein szelektíven kicsapódik. Ezt bizonyítja az is, hogy a csapadékban lévő glikoproteineket további detergens hozzáadása nélkül nem lehet oldatba vinni. A detergens a polietilénglikolhoz hasonló kémiai szerkezete következtében a polietüénglikolt tartalmazó felülúszóban marad. Úgy találtuk, hogy 8 tömegszázalék polietüénglikol 6000 maradéktalanul kicsapja a protektiv glikoproteineket. Minthogy a polietüénglikol hidrofób természetű, a hasonló tulajdonságú lipidek is a polietüénglikol fázisban maradnak. A 10 mintával készített kísérlet eredménye alapján a glikoproteineket tartalmazó kiindulási felülúszóhoz a nagy molekulatömegű szennyező sejt- és vírusfehérjéknek az oldatból való eltávolítása céljából első tisztítási lépésként az oldat végkoncentrációjára számított 3,5 tömegszázalék polietüénglikol 6000 anyagot adagoltunk, majd az elegyet egy éjszakán (kb. 16 órán) át +4°C hőmérsékletű hűtőszekrényben állni hagytuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
