203675. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alegység-vakcina előállítására a sertések Aujeszky-féle betegsége ellen
1 HU 203 675 B 2 A találmány tárgya eljárás Aujeszky-féle betegség elleni alegység-vakcina előállítására, amelynek során az Aujeszky-féle betegség vírusából vagy legalább annak protektiv antigénjéből előállított szaporított vagy tenyésztett állományból indulunk ki, az állományt nem ionos vagy zwitterionos detergenssel szolubilizáljuk, a vírus nukleokapszidot eltávolítjuk, az antigént tartalmazó vírus glikoproteineket elkülönítjük és a detergenst eltávolítjuk. Az Aujeszky-féle betegség vírusa a sertések, valamint - az ember kivételével - szinte valamennyi emlős állatfaj fontos kórokozója. Kártételét az USA sertésállományaiban a viszonylag alacsony mértékű fertőzöttség ellenére évente több millió dollárra becsülik. Az Aujeszky-féle betegség előfordulását Japán és Ausztrália kivételével a világ valamennyi országában megfigyelték, ez idáig csak egy-két fertőzött ország - pl. Dánia - állományait sikerült mentesíteni (Gustafson, D. P.: Pseudorabies című fejezet a Leman, A. D. és társai által szerkesztett Diseases of swine (Sertésbetegségek) 5th ed., The Iowa State University Press, Ames,Iowa,USA 1981.könyvből). Míg az Aujeszky-féle betegség elleni küzdelem célja korábban csak az elhullásból és a klinikai tünetekben megnyüvánuló megbetegedésből eredő közvetlen gazdasági kár megelőzése volt, addig a korszerű állategészségügyi törekvések a sertésállományok Aujeszky-féle betegség vírusától való mentesítésére irányulnak. A mentesítésre eddig alkalmazott eljárások, az SPF módszer, a zsüipezési eljárás (Mészáros, J. et al.: Vet. Rec. 1985,116,8.) vagy a teljes állománycsere rendkívül költségigényesek, és a védtelen állomány - rendszerint az elégtelen izoláció következtében - fertőzött környezetéből gyakran visszafertőződik. A vakcinás immunitás „árnyékában" végzett mentesítés a hagyományos oltóanyagokkal megvalósíthatatlan, ugyanis a vakcinára adott szerológiai válasz a vadvírussal történő (interkurrens illetve korábbi) fertőződés nyomán kialakuló áthangolódástól nem különböztethető meg. Ennek gyakorlati jelentősége az lenne, hogy a fertőződött egyedek mielőbbi eltávolításával megakadályozzuk a fertőzés tovaterjedését az állományban. Az Aujeszky-féle betegség esetében különös gondot okoz, hogy a vírus - a többi herpeszvírushoz hasonlóan - idősebb állatok szervezetében latens vírushordozást képes kialakítani, és ezt a jelenleg használatos oltóanyagok egyike sem képes megakadályozni (áttekintés: Devaney, Margaret A.: CRC Crit. Rev. Microbiol. 1988.15,269.). A világon jelenleg többféle, különböző mértékben csökkent vagy csökkentett megbetegítőképességű, élő vírust tartalmazó vakcina használatos. Ezek többnyire a klinikai megbetegedést és a testsúlycsökkenésből, illetve az egészségesen fejlődő állatokhoz hasonló testsúly eléréséhez szükséges továbbtartásból eredő gazdasági kárt képesek kivédeni, de sem a vadvírus-ürítést, sem pedig a látencia kialakulását nem képesek megakadályozni. Egyes törzsek a virulenciacsökkenésért felelős génszakasz (unique short region) deléciójával összefüggésben nem tartalmazzák a glikoprotein I-t (gl) - pl. Bartha K/61, Norden (a BUK-törzs származéka) -, ennek következtében lehetőség van a vadvírustól való szerológiai elkülönítésre. Minthogy álta- 6 Iában ugyancsak nem tartalmazzák a neurovirulenciáért felelős timidin-kináz gént sem, az ezzel kapcsolatos megbetegítőképességük is hiányzik. Az utóbbi évek kutatásai kiderítették, hogy a protektivitásért elsősorban^ gin (illetve gp50) felelős, bár 10 más nézetek szerint e tekintetben lényeges minden olyan glikoprotein, amellyel szemben termelődött ellenanyag - komplement jelenlétében vagy anélkül - in vitro semlegesíteni képes a vírus hatását. A sejtes immunitás, amelynek éppen a herpeszvírusok esetében 15 nagy jelentőséget tulajdonítanak, ugyancsak a felszíni antigének felismerésén alapszik. A legutóbbi vizsgálatok szerint pl. a gll jelzésű glikoprotein a vírus in vitro szaporodásához nem feltétlenül szükséges, azonban azok a mutánsok, amelyekből hiányzik a gin-at kódo- 20 ló génszakasz (ilyen a Bartha K/61 törzs is), következetesen 3-20-szor alacsonyabb titerben termelődnek a vad, illetve glü-pozitív törzsekhez képest, ami jelentős hátrány a vakcinatermelés során (Schreurs, Christa et al.:J. Virol. 1988,62,2251.). 25 Ezek figyelembevételével az a következtetés vonható le, hogy az egyes glikoproteinek gyakorlati jelentőségének megítélése során nem elegendő a vírus in vitro szaporodásához való szükségesség vagy szükségtelenség. 30 A fenti szempontokat is figyelembe véve az Aujeszky-féle betegség elleni vakcinák közül leginkább az ún. alegység-vakcinák tekinthetők optimálisnak, amelyek - legalábbis túlnyomórészben - csak a protektiv antigéneket tartalmazzák. 35 A szakirodalom tanulsága szerint laboratóriumi méretekben hatékony alegység-vakcinákat állítottak elő az Aujeszky-féle betegség vírusából, illetvp egyéb herpeszvírusokból (Maes, R. K. and Schutz, J. C: Am. J. Vet. Rés. 1983,44, 123.; Kit, S. and Kit, M.: Clin. 40 Obstet, Gynecol. 1985,28,164.). A kísérleti herpeszvírus alegység-vakcinák előállítása során legtöbb esetben ultracentrifugálással tisztított vírust, vagy a teljes vírussal fertőzött sejttenyészetet felületaktív anyaggal (detergenssel) kezelték, 45 ami a lipidekből álló sejthártyák és a hasonló szerkezetű, sejtmembránokból származó vírusenvelopok dezintegrálódását eredményezi. Erre a célra nemionos detergenst (oktilfenil-polietilénglikoléter - Triton X100, vagy az időközben megszüntetett gyártású No- 50 nidet P-40 - NP40), ún. zwitterionos (ikerionos) detergenseket (kolamidopropü-dimetilammoniopropánszulfonát - CHAPS; Jennings, R. et al.: Arch. Virol. 1988,98,137.), vagy a későbbi dialízissel történő detergens-eltávolításhoz kedvezően magas kritikus mi- 55 cella-koncentrációjú oktüglukozidot használtak. A detergens hatására a protektiv antigéneket hidrofób szekvenciájukkal magában foglaló envelop lipiddetergens, glikoprotein-detergens, valamint lipid-glikoprotein-detergens micellákká alakul, a komponen- 60 sek arányától függően. A kezelés a nukleinsavat tártál-I i 2
