203675. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alegység-vakcina előállítására a sertések Aujeszky-féle betegsége ellen
1 HU 203 675 B 2 mazó belső vírusmagot (nukleokapszid, core) rendszerint érintetlenül hagyja, amely nagyobb méreténél fogva pl. ultracentrifugálással kiülepíthető. Ezzel a tisztítási eljárással kapcsolatosan meg kell jegyezni, hogy a nukleokapszid fehérjéinek eltávolítása távolról sem teljes. Ennek oka egyrészt az, hogy a lecsupaszított nukleokapszid nem st&bü, spontán szétesésre és aggregalódásra hajlamos, a detergens-kezelést kővetően gyakorlatilag azonnal bomlásnak indul, felbomlott állapotban pedig ultracentrifugálással nem távolítható el. Másik okként említhető, hogy a nukleokapszid-fehérjék, a vírus-nukleinsavhoz hasonlóan az érett (komplett) vírusrészecskékbe épült mennyiséghez képest nagy feleslegben szintetizálódnak, nagyobb részük a sejtben vagy a sejttenyészetek felülúszójában szabadon marad. A tisztítási lépéseknek a korábban említett differenciál-diagnosztika, továbbá a vakcina hatékonysága és biztonságossága szempontjából van jelentőségük. A nemionos detergensek a sejtmagot is épségben hagyják, amely alacsony gyorsulással kicentrifugálható. A szennyezésnek minősíthető sejt- és tápfolyadékfehérjéket a kutatók egy része egyáltalán nem távolította el a vakcinából. Platt immobilizált lektinnel végzett affinitás-kromatográfiával tisztította a protektiv antigénfrakciót képviselő glikoproteineket. Amellett, hogy ez a módszer kifogásolható a protektiv antigének megőrzése szempontjából (Marchioli, Carmine C. et al: J. Virol. 1987,61,3977.), meg kell említeni, hogy egyfelől nem szelektív a víruseredetű glikoproteinekre nézve, tehát az eluált frakció a sejtmembránból származó gazdasejt-glikoproteineket is tartalmazza (ami egyébként, pl. fajazonos sejttenyészetben végzett vírusszaporítás esetében nem feltétlenül hátrány), másfelől az eluálás során a lektin-glikoprotein komplex megbontásához használt cukorszármazékok nem olcsóak. Az eljárás során alkalmazott és szintén költséges hordozók élettartama és kapacitása véges. A különböző kolloid szerkezetű Semliki Forest vírus-antigének immunogenitásának összehasonlítása azt eredményezte, hogy a tiszta, „monomer” glikoprotein-detergens micellák immunizáló képessége közel két nagyságrenddel gyengébb, mint a polimernek tekinthető tiszta fehérjemicelláké vagy a rekonstruált lipidmembrán-hólyagocskákba inzertált glikoproteineké, azaz viroszómáké (Balcarova, J. et al.: J. Gén. Virol. 1981, S3, 85.) és a QuUlaja saponaria Molina kérgéből származó szaponin-frakcióval (Spikosiddal) képzett ún. ISCOM komplexé (immunoítimulating complex; Morein, B. et al.: Nature 1984,308.457.). A közölt fehér jemicella előállítási eljárás hátránya, hogy többszöri gradiens-ultracentrifugáláson alapszik, ami idő- és munkaigényessége, valamint korlátozott volumene miatt a nagyüzemű előállítást a jelenlegi technikai szinten lehetetlenné teszi. A membránhólyagocskákba történő integrálást a dialízissel kezelhető ugyancsak korlátozott térfogat, valamint az alkalmazott oktü-glukozid magas ára teszi a gyakorlat számára alkalmatlanná. Az ISCOM előállítását az ultracentrifugálás szükségessége a fentiekhez hasonlóan költségessé teszi. A detergensek szerves oldószerekben (alkohol, aceton) is oldódnak, így a detergenssel szolubUizált antigén-keverékből szerves oldószerrel elegyítve a fehérjék (és egyéb nagy molekulatömegű anyagok) kicsapódnak, a detergens pedig a felül úszóban visszamarad. E módszer hátrányai közül a durva dehidratálást követő fehérjedenaturálódást, az ebből adódó rosszabb immunogenitást és a nagy szerves oldószerszükségletet kell megemlíteni. A szerves oldószerrel végzett fehérjekicsapás a fehérjéket tekintve természetesen nem szelektív. A találmány célja új eljárás létrehozása alegységvakcina előállítására a sertések Aujeszky-féle betegsége ellen, amelynek segítségével a vírusenvelop protektiv membránfehérjéi jó immunogenitású formában, gazdaságosan állíthatók elő. Felismertük, hogy az Aujeszky-féle betegség ellen ultracentrifugálás nélkül nagyüzemi úton lehet alegység vakcinát előállítani, ha a polietilénglikolt a szolubilizált vírustenyészet frakciónál! kicsapására használjuk fel oly módon, hogy első alkalmazásakor a vírusnak és a gazdasejtnek a protektiv immunválasz kiváltása szempontjából szükségtelen összetevőit választjuk el, majd másodszor magasabb koncentrációjú alkalmazása mellett a protektiv glikoproteineket különítjük el. A találmány szerinti eljárás során az Aujeszky-féle betegség vírusából vagy annak protektiv antigénjéből előállított szaporított vagy tenyésztett állományból indulunk ki, az állományt nemionos vagy zwitterionos detergenssel szolubUizáljuk, a vírus nukleokapszidot eltávolítjuk, az antigént tartalmazó vírus glikoproteineket elkülönítjük és a detergenset eltávolítjuk, amelynek során a detergenssel szolubUizált oldathoz 4000-8000 dalton móltömeg közé eső polietilénglikolt adagolunk az oldatra vonatkoztatott 2-5 tőmegszázalék, előnyösen 3,5 tömegszázalék mennyiségben, majd a keletkezett csapadékot a csapadékképződés befejeződését követően eltávolítjuk, a felülúszóhoz további polietilénglikolt adagolunk, ameddig az oldatban koncentrációja 7-10 tőmegszázalékot elér, majd a keletkezett csapadékot a csapadékképződés befejeződését követően elkülönítjük és a csapadékot puffer oldatban reszuszpendáljuk, majd elkülönítjük. A polietUénglikol kis mennyiségben való hozzáadásával a vírusnak és a gazdasejtnek a protektiv immunválasz kiváltása szempontjából szükségtelen összetevőit választjuk el. A csapadék nem tartalmazza azonban a protektiv antigéneket reprezentáló vírus glikoproteineket, így a csapadék eltávolításával hatásos tisztítást érhetünk el. Amikor a polietUénglikol mennyiségét a második lépésben 4-5 tömegszázaléknál magasabbra állítottuk be, akkor a glikoprotein-detergens micellák disszociáltak, és belőlük a glikoprotein szelektíven kicsapódott. A csapadék elkülönítésével tehát az alegység vakcina hatóanyagául szolgáló protektiv anyagot egy5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
